一种多位点双重碱基编辑器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多位点双重碱基编辑器及其应用，属于生物技术领域。首先，利用构建的单质粒编辑器骨架，通过胞嘧啶脱氨酶、UGI、腺嘌呤脱氨酶与dCas12a构成的融合蛋白的组成与结构优化，实现了单个crRNA阵列引导下多个位点的双重编辑；在此基础上，通过启动子替换、crRNA阵列中的人工间隔序列的引入与优化以及DR基序的改造，进一步提高了多位点编辑的效率；最后，通过多抗性菌株生成、核黄素合成菌株的从头产生以及表面活性素合成菌株的产量提升，验证了该多位点双重碱基编辑器的功能。本发明专利技术拓宽了双重碱基编辑器在基因组上的可操作范围，并实现基因组上多个位点的同时双重编辑，可以在单个crRNA阵列的引导下对基因组上多个位点同时进行编辑。多个位点同时进行编辑。多个位点同时进行编辑。

【技术实现步骤摘要】
一种多位点双重碱基编辑器及其应用


[0001]本专利技术涉及一种多位点双重碱基编辑器及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]基因编辑是通过在DNA上特定位点引入序列改变，达到基因的敲除、外源DNA片段插入或者DNA碱基突变的技术手段。近年来，CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR
‑
associatedproteins)系统在基因编辑中得到了非常广泛的应用，特别是CRISPR/Cas9系统。在该系统中，未成熟的前体CRISPR RNA(pre
‑
crRNA)可以与tracrRNA(trans
‑
activating crRNA)相互结合，并在RNA酶III的作用下形成crRNA:tracrRNA复合物，引导Cas9蛋白识别并切割基因组上的特定位点产生双链断裂；然后，通过同源重组修复(HDR)便可将同源模板上的序列改变引入到基因组的目标靶点上；或者，也可以通过非同源末端连接(NHEJ)的方式直接将断裂的DNA片段进行连接，并产生随机的插入或缺失(Indel)。由于未被修复的双链断裂是致死的，只有成功修复并引入突变使得Cas9不再识别和切割的细胞才能存活下来，这就是利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的基本原理。
[0003]为了简化操作过程并提高编辑效率，常常将crRNA和tracrRNA构建成一个嵌合体即sgRNA(small guide RNA)进行表达，这样只需要表达sgRNA和Cas9蛋白便可进行基因编辑。目前除了CRISPR/Cas9系统以外，CRISPR/Cas12a系统(也被称作CRISPR/Cpf1)也常被应用于基因编辑，与CRISPR/Cas9系统不同的是，CRISPR/Cas12a只需要crRNA便可发挥作用；而且Cas12a自身就具有RNA酶的活力，可以对未成熟的包含多个crRNA的mRNA序列进行切割加工；因此，可以设计一段包含多个crRNA的crRNA阵列，当其被Cas12a加工成熟后，可以产生多个具有独立功能的crRNA并引导Cas12a靶向基因组的对应靶点，实现多个位点的同时编辑。
[0004]很多物种都缺少NHEJ途径(即使有活性也较弱)，而HDR途径需要同源模板的参与才能发挥作用，且这两种修复机制之间还会存在竞争关系，这都导致基于上述方式的基因编辑过程致死率较高且编辑效率较低。将Cas9的DNA酶进行失活后，可以得到只能切割一条DNA链的nCas9和无法切割DNA的dCas9。nCas9与dCas9仍然可以在sgRNA的引导下结合到基因组的特定位点，但却不会产生致死的双链断裂。类似的，将Cas12a的DNA酶活性进行失活后，可以得到无法切割DNA的dCas12a，dCas12a也可以在crRNA的引导下结合到基因组的特定位点且亦不会产生致死的双链断裂；此外，由于dCas12a的RNA酶活性得以保留，使其能够在单个crRNA阵列引导下靶向基因组的多个不同位点。
[0005]胞嘧啶脱氨酶可以催化胞嘧啶(C)脱氨转化为尿嘧啶(U)，并进一步通过DNA修复或复制将U转化为胸腺嘧啶(T)；腺嘌呤脱氨酶TadA及其突变体则可将腺嘌呤(A)脱氨形成肌苷(I)，在DNA水平肌苷会被当作鸟嘌呤(G)进行读码和复制，最终实现A
→
G的转换。如图1a所示，将胞嘧啶脱氨酶与nCas9或dCas9进行融合构建胞嘧啶碱基编辑器(CBE)，能够在sgRNA的引导下实现不依赖于双链断裂的基因组碱基编辑(C
→
T)；而通过进一步融合来源
于噬菌体PBS的尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)来抑制胞内的尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil DNA N
‑
glycosylase，UNG)的活性，阻止碱基错配修复途径(Base excision repair,BER)将编辑产生的U
·
G修复恢复为C
·
G配对，可以进一步提高碱基编辑的效率。如图1b所示，将腺嘌呤脱氨酶与nCas9或dCas9进行融合构建腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，可以在sgRNA的引导下实现基因组上特定位点的A
→
G转化。此外，通过同时将胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶同时与nCas9或dCas9进行融合构建双重编辑器(duBE)，可以在sgRNA的引导下同时实现基因组上特定位点的C
→
T与A
→
G转换。
[0006]Cas9所识别的位点需要具有NGG(N＝A,T,C,G)的PAM序列，这限制了基于Cas9的双重碱基编辑器在基因组上的可操作范围；此外，引导Cas9的每一个sgRNA都需要完整的转录单元，在进行多位点碱基编辑时(C
→
T与A
→
G)需要构建多个对应的sgRNA表达框，如此不仅增加了构建过程的复杂性，还会由于启动子等元件的重复使用而降低DNA序列的稳定性。基于CRISPR/Cas9的双重碱基编辑器在基因组上的可操作范围受限，而且在多位点的碱基编辑(C
→
T与A
→
G)过程中效率低且操作复杂。基于dCas12a的CBE或者ABE都已被成功构建，其PAM序列为TTV(V＝A,C,G)，因此扩充了基因组上可编辑的范围。然而，如何对胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶以及dCas12a进行耦合才能够同时保持三者的活性(C
→
T、A
→
G及crRNA阵列加工与DNA靶向)，从而实现CRISPR/Cas12a介导的多位点双重碱基编辑(C
→
T与A
→
G)尚未有相关的报道。

技术实现思路

[0007]为解决上述问题，本专利技术开发了基于dCas12a的多位点双重碱基编辑器(MultiduBE)，其可以在单个crRNA阵列的引导下对基因组上多个位点同时进行高效编辑(C
→
T与A
→
G)。首先，利用构建的单质粒编辑器骨架，通过胞嘧啶脱氨酶、UGI、腺嘌呤脱氨酶与dCas12a构成的融合蛋白的组成与结构优化，实现了单个crRNA阵列引导下多个位点的双重编辑(C
→
T与A
→
G)；在此基础上，通过启动子替换、crRNA阵列中的人工间隔序列的引入与优化以及DR基序的改造，进一步提高了多位点编辑的效率；最后，通过多抗性菌株生成、核黄素合成菌株的从头产生以及表面活性素合成菌株的产量提升，验证了该多位点双重碱基编辑器(MultiduBE)的功能。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种多位点双重碱基编辑器，所述多位点双重碱基编辑器包括含有胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)、腺嘌呤脱氨酶TadA、缺陷型核酸酶dcas12a和crRNA插入区的质粒；其中：
[0009]当胞嘧啶脱氨酶为hAPOBEC3A时，腺嘌呤脱氨酶TadA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多位点双重碱基编辑器，其特征在于，所述多位点双重碱基编辑器包括含有胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制剂、腺嘌呤脱氨酶TadA、缺陷型核酸酶dcas12a和crRNA插入区的质粒；其中：当胞嘧啶脱氨酶为hAPOBEC3A时，腺嘌呤脱氨酶TadA位于所述hAPOBEC3A之后；当胞嘧啶脱氨酶为hAID时，腺嘌呤脱氨酶TadA位于所述hAID之前。2.根据权利要求1所述的多位点双重碱基编辑器，其特征在于，所述质粒上的各元件顺序为以下任一种：(1)由前到后为胞嘧啶脱氨酶hAPOBEC3A、腺嘌呤脱氨酶TadA、缺陷型核酸酶dcas12a、尿嘧啶糖苷酶抑制剂；(2)由前到后为腺嘌呤脱氨酶TadA、胞嘧啶脱氨酶hAID、缺陷型核酸酶dcas12a、尿嘧啶糖苷酶抑制剂。3.根据权利要求1所述的多位点双重碱基编辑器，其特征在于：所述crRNA插入区连接有crRNA阵列。4.根据权利要求3所述的多位点双重碱基编辑器，其特征在于：所述crRNA阵列为组成型表达，所述胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制剂、腺嘌呤脱氨酶TadA和缺陷型核酸酶dcas12a为诱导型表达。5.根据权利要求4所述的多位点双重碱基编辑器，其特征在于：所述胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制剂、腺嘌呤脱氨酶TadA和缺陷型核酸酶dcas12a由阻遏蛋白LacI和P
grac100
启动子调控表达，或由阻遏蛋白TetR和P
tet
启动子调控表达。6.根据权利要求3
‑
5任一项所述的多位点双重碱基编辑器，其特征在于：所述crRNA阵列由P
veg
启动子调控表达。7.根据权利要求3
‑
5任一项所述的多位点双重碱基编辑器，其特征在于：在所述crRNA阵列中插入核苷酸序列如SEQ ID NO.6
‑
9所示的人工间隔序列。8.根据权利要求7所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，武耀康，李洋，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：