一种用于生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开一种用于生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用，该大肠杆菌工程菌株的构建方法包括：以大肠杆菌为出发菌株，基因组上敲除葡萄糖磷酸化和转运的相关基因crr，并强化半乳糖/氢离子协同转运蛋白编码基因galp和葡萄糖激酶编码基因glk的表达，利用自我调节型启动子P

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于合成生物学和代谢工程领域，涉及一种用于生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用。
技术背景
[0002]四氢嘧啶是一种环化的氨基酸衍生物，分子式为C6H
10
O2N2，分子量为142.16，其性质稳定、不易分解，生理pH范围内不带电荷，无气味，极具亲水性。四氢嘧啶于1985年Galinski等人在嗜盐光合细菌Ectothiorhodospira halochloris DSM 1059中发现，可以保护细胞、酶和DNA免受高温、高渗、冷冻、干燥、辐射等极端环境条件的破坏，因此在生物技术、生物医药和化妆品等行业有非常广阔的研究及应用前景。
[0003]四氢嘧啶含有一个手性碳原子，因此化学合成工艺复杂、效率低，产生的副产物和目的产物化学性质相似，下游分离纯化难度大，且要使用有毒试剂，污染环境。相比之下，微生物发酵法具有条件温和、环境友好、成本低等优势，已成为生产四氢嘧啶的首选工艺。
[0004]嗜盐菌发酵法采用“细菌挤奶”工艺进行生产，利用嗜盐菌在高盐离子培养基中合成积累四氢嘧啶，在低盐离子培养基中释放四氢嘧啶以维持细胞内外渗透平衡，通过“高盐诱导——低盐释放”的多轮冲击积累四氢嘧啶。这种方法操作复杂、成本较高，同时高盐培养基会腐蚀设备、影响菌体生长，从而影响最终产量，也增加了下游分离纯化和废水处理的成本。
[0005]目前，在常用的工业化生产菌株(如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌)中外源导入四氢嘧啶合成基因簇，通过代谢工程优化合成途径，使其在完全不依赖盐激诱导的培养基中以葡萄糖为底物高效合成积累四氢嘧啶，已广泛应用于四氢嘧啶的大规模生产。为平衡菌株的生长与生产，大部分工作在重组菌株中引入外源四氢嘧啶合成基因时选择使用诱导型启动子，然而诱导剂的使用会带来成本、毒性、调控精度、基因泄漏等问题。因此构建一种既能平衡生长生产、又不需添加诱导剂的四氢嘧啶高产菌株从而简化生产工艺、降低生产成本，对推动四氢嘧啶的产业发展有重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种用于生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用，从而解决现有技术中为了合成四氢嘧啶添加诱导剂导致的生产成本增加、细胞生长受损伤、调控精度不高、以及基因泄漏等问题。
[0007]为了解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]根据本专利技术的第一方面，提供一种生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株的构建方法，该方法包括：以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌中编码葡萄糖磷酸化和转运的相关基因crr敲除，分别强化半乳糖/氢离子协同转运蛋白编码基因galp、葡萄糖激酶编码基因glk的表达，还将四氢嘧啶合成质粒pTrc99a
‑
ectABC上的诱导型启动子Ptrc替换为自我调节型
启动子P
yciG
、P
ybgS
、P
otsB
中的至少一种，即可获得一种感应生长状态自动生产四氢嘧啶的重组大肠杆菌。
[0009]本领域技术人员应当理解的是，出发菌株可以是大肠杆菌W3110，也可以是经过基因改造后能合成丰富草酰乙酸OAA前体的大肠杆菌菌株。
[0010]在本专利技术的具体实施方式中，采用的出发菌株是经过基因改造后富含前体OAA的大肠杆菌菌株ECT00/pTrc99a
‑
ectABC(以大肠杆菌W3110为出发菌株，强化ppc基因、敲除iclR基因、部分敲除thrA基因，并将来源于伸长盐单胞菌Halomonas elongata的四氢嘧啶合成基因簇构建到pTrc99a质粒上获得，具体见参考文献Ning Y,Wu X,Zhang C,et al.Pathway construction and metabolic engineering for fermentative production of ectoine in Escherichia coli[J].Metab Eng,2016,36:10
‑
18.)。
[0011]根据本专利技术的一个优选方案，大肠杆菌工程菌株的构建方法包括任意顺序的以下步骤：A、敲除所述出发菌株中的crr基因；B、过表达所述出发菌株中的galP基因；C、过表达所述出发菌株中的glk基因；D、将四氢嘧啶合成质粒pTrc99a
‑
ectABC上的诱导型启动子替换为自我调节型启动子P
yciG
、P
ybgS
、P
otsB
中的至少一种。
[0012]所述编码葡萄糖磷酸化和转运的相关基因crr的Gene ID：946880；所述半乳糖/氢离子协同转运蛋白编码基因galp的Gene ID：947434；所述葡萄糖激酶编码基因glk的Gene ID：946858。
[0013]进一步，大肠杆菌工程菌株通过Ptrc启动子调控半乳糖/氢离子协同转运蛋白编码基因galp。
[0014]进一步，大肠杆菌工程菌通过Ptrc启动子调控葡萄糖激酶编码基因glk。
[0015]进一步，所述Ptrc启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0016]进一步，所述P
yciG
启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述P
ybgS
启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述P
otsB
启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
[0017]进一步，所述crr基因核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，galP因核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示，glk核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。
[0018]本专利技术的第二方面，提供一种根据上述构建方法得到的生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株。
[0019]本专利技术的第三方面，提供一种所述大肠杆菌工程菌株在生产四氢嘧啶或含四氢嘧啶的产品中的应用。
[0020]进一步，在发酵培养之前，将所述基因工程菌划线至固体培养基上活化，再接种至种子培养基中培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
[0021]进一步，所述应用是将所述基因工程菌活化后在种子培养基中培养得到种子液，其中培养温度为35～37℃，pH为7.0～7.2，控制溶氧为30％～40％，再将种子液按20％～30％的接种量接种至发酵培养基。
[0022]进一步，所述发酵培养基组成为：25～30g/L葡萄糖，5～10g/L酵母粉，1～5g/L蛋白胨，1～2g/L磷酸二氢钾，1～2g/L柠檬酸，0.5～1g/L氯化钠，0.5～2g/L七水硫酸镁，0.05～0.1mg/L生物素，1～2.5mL/L微量元素溶液，调节pH为7.0～7.2。
[0023]进一步，所述发酵条件为：在37℃条件下发酵，通过关联搅拌桨转速使溶氧维持在30％～40％，通过自动流加氨水调节pH维持在7.0～7.2，通过自本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，基因组上敲除葡萄糖磷酸化和转运系统的可溶性酶的编码基因crr，过表达半乳糖/氢离子协同转运蛋白编码基因galp和葡萄糖激酶编码基因glk，将四氢嘧啶合成质粒pTrc99a
‑
ectABC上的诱导型Ptrc启动子替换为自我调节型启动子P
yciG
、P
ybgS
、P
otsB
中的至少一种，即可获得一种感应生长状态自动生产四氢嘧啶的重组大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括任意顺序的以下步骤：A、敲除所述出发菌株中的crr基因；B、过表达所述出发菌株中的galP基因；C、过表达所述出发菌株中的glk基因；D、将四氢嘧啶合成质粒pTrc99a
‑
ectABC上的诱导型启动子替换为自我调节型启动子P
yciG
、P
ybgS
、P
otsB
中的至少一种。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，作为出发菌株的大肠杆菌可采用：大肠杆菌W3110，或经过基因改造后能合成丰富草酰乙酸OAA前体的大肠杆菌菌株。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述自我调节型启动子P
yciG
、P
ybgS

【专利技术属性】
技术研发人员：刘敏，陶欣艺，魏东芝，刘子为，马昱澍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：