一种酶法合成UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的方法技术

本发明专利技术涉及UDP

【技术实现步骤摘要】
一种酶法合成UDP
‑
葡萄糖醛酸和UDP
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖的方法


[0001]本专利技术涉及一种酶法合成UDP
‑
葡萄糖醛酸和UDP
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖的方法，属于生物工程及生物合成


技术介绍

[0002]UDP
‑
葡萄糖醛酸(uridine
‑5’‑
diphosphate glucuronic acid，UDP
‑
GlcA)、UDP
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖(uridine
‑5’‑
diphosphate N
‑
acetylglucosamine，UDP
‑
GlcNAc)属于糖核苷酸，是相应的单糖异头体羟基与尿苷二磷酸连接形成的。糖核苷酸广泛存在与多种生物细胞内，在各类体内外研究中起到了不可或缺的作用。在生物体内，糖核苷酸作为单糖的高能供体底物，参与生物细胞和机体内多种糖代谢途径与重要的糖基化过程。糖胺聚糖如透明质酸、硫酸软骨素、肝素等，其分子的基本二糖骨架单位中含有葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖。因此，UDP
‑
GlcA和UDP
‑
GlcNAc可作为糖基供体，在糖胺聚糖寡糖链的合成与相关糖基转移酶和分子生物学研究中具有重要应用。同时两者还可以在适当的酶催化下转化为其他尿苷二磷酸糖类，因此在糖核苷酸的相关研究中也具有重要的研究价值。
[0003]目前，UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc的获取方法主要有直接提取法、化学法及酶法。直接提取法因二者在植物和哺乳动物细胞内的浓度大多处于pmol或nmol级别，因此难以大量获得，目前也尚无以直接提取的方式规模化制备UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc的报道；UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc固有的性质使化学法合成具有一定难度。化学法合成UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc存在合成步骤繁琐、催化产率低等缺点，目前还没有通用的可以高效合成UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc的化学法；酶法方便，收率较高，并且具有合成步骤相对较少、反应温和等优点。专利DE102018116200公开了利用糖核苷酸的Salvage Pathway路线及途径酶进行UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc的合成，以及利用PPiase对反应中PPi进行降解的技术方案，但是，Salvage Pathway路线进行合成中会发生副产物PPi的积累，并且反应需要ATP进行能量供应。对于如何解决利用糖核苷酸的Salvage Pathway路线合成UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc时的副产物PPi积累以及ATP再生的问题，现有技术均是利用一种酶先将副产物PPi降解，再用另一种酶催化添加的磷酸供体(PolyP
n
)实现ATP的循环再生。

技术实现思路

[0004][技术问题][0005]本专利技术要解决的技术问题是以酶法制备UDP
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葡萄糖醛酸和UDP
‑
N
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乙酰氨基葡萄糖时，酶转化率低、副产物积累及ATP供应不足导致的反应产率低的问题。
[0006][技术方案][0007]为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术提供了酶法高效大量制备UDP
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葡萄糖醛酸(UDP
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GlcA)和UDP
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N
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乙酰氨基葡萄糖(UDP
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GlcNAc)的方法。本方法所使用的是糖核苷酸的Salvage Pathway路线。本方法通过较为廉价的葡萄糖醛酸(GlcA)和N
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乙酰
‑
葡萄糖
胺(GlcNAc)为底物，分别经过两步反应，最终得到昂贵的UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc；通过偶联聚磷酸激酶，利用反应副产物腺苷二磷酸(ADP)、焦磷酸(PPi)实现腺苷三磷酸(ATP)的循环，提高反应转化率，降低生产成本；最后将体系扩大、提高底物浓度实现UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc的高效大量制备。
[0008]本专利技术披露了一种酶法制备UDP
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GlcA和UDP
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GlcNAc的方法，所述方法分别以GlcA为底物以葡萄糖醛酸激酶(GlcAK)、UDP
‑
葡萄糖醛酸焦磷酸化酶(USP)催化制备UDP
‑
GlcA；以GlcNAc为底物，以N
‑
乙酰己胺1
‑
激酶(NahK)或N
‑
乙酰葡糖胺激酶(AmgK)，偶联UDP
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(GlmU)催化制备UDP
‑
GlcNAc，所述方法还使用聚磷酸激酶(PPK)同时降解PPi并利用ADP合成ATP，实现减少副产物PPi和ATP的循环再生的目的。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述GlcAK来源于Arabidopsis thaliana或Danio rerio，编码GlcAK的基因的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2，GlcAK的氨基酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述USP来源于Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697，编码USP的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5，USP的氨基酸序列为SEQ IDNo.6。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述NahK来源于Bifidobacterium longum subsp.longum JCM 1217，编码NahK的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.7，NahK的氨基酸序列为SEQ IDNo.8。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述AmgK来源于Pseudomonas putida KT2440或Pseudomonas aeruginosa，编码AmgK的基因的核苷酸序列分别为SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10，AmgK的氨基酸序列分别为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述GlmU来源于Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Escherichia c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法合成UDP
‑
葡萄糖醛酸和UDP
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，制备UDP
‑
GlcA时，以GlcA为底物以葡萄糖醛酸激酶(GlcAK)、UDP
‑
葡萄糖醛酸焦磷酸化酶(USP)催化制备UDP
‑
GlcA，以聚磷酸激酶(PPK)降解PPi的同时利用ADP合成ATP；制备UDP
‑
GlcNAc时，以GlcNAc为底物，以N
‑
乙酰己胺1
‑
激酶(NahK)或N
‑
乙酰葡糖胺激酶(AmgK)，偶联UDP
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(GlmU)催化制备UDP
‑
GlcNAc，以聚磷酸激酶(PPK)降解PPi的同时利用ADP合成ATP。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GlcAK来源于Arabidopsis thaliana或Danio rerio；所述USP来源于Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697；所述NahK来源于Bifidobacterium longum subsp.longum JCM 1217；所述AmgK来源于Pseudomonas putida KT2440或Pseudomonas aeruginosa；所述GlmU来源于Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Escherichia coli、Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus或Pseudomonas putida；所述PPK来源于Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述GlcAK、USP、NahK、AmgK、GlmU、PPK是以pET
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【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，李佳莲，堵国成，王阳，胡立涛，胥睿睿，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：