【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利涉及一种从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，属于生物医学。
技术介绍
1、随着基因测序技术的飞速发展，单细胞测序成为近年来最为热门的测序新技术。它可以在单个细胞水平上对细胞内的所有核酸分子(包括dna和rna)以及修饰核苷酸进行测序和分析，实现了对单细胞全基因组、转录组和表观组的解析，解决了传统组织水平测序所不能解决的细胞异质性问题，可以揭示细胞间的遗传信息差异，发现新的细胞类型和新型细胞标志物。早在2009年，nature methods就首次介绍了单细胞转录组测序，文章中首次将单细胞转录组扩增和高通量测序技术相结合，成功的对单个细胞内的全转录组进行测序。而2015年左右发展起来的高通量的单细胞测序技术可以实现同时对成千上万个细胞进行测序和分析，单细胞测序技术获得跨越式发展。高通量的单细胞测序技术目前主流的技术平台有微孔(microwell)、微液流(microfluidic)和微液滴(droplet)三种，而基于微孔板和微液滴技术商业化最成功的例子是bd rhapsody和10x genomics next gem chromium平台，后者技术更为成熟，细胞的捕获通量相对更高，逐渐成为目前主流的高通量单细胞测序技术。
2、单细胞测序的全实验流程包括单细胞悬液制备、单细胞捕获和标记、文库制备、上机测序以及生物信息学分析和数据解读五个步骤，其中获得高质量高活性的单细胞悬液是整个实验和数据分析的基础，被公认为最为关键的步骤。细胞悬液的数量、活性的高低、杂质和污染等会直接影响有效的单个细胞的捕获效率
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法。
2、本专利技术采用的技术方案为：一种从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其步骤包括：
3、(1)对小鼠内脏组织进行预处理后，剪碎；
4、(2)将处理后的组织放入混合酶解离液中进行初步消化解离；
5、(3)对酶解产物进行机械吹打以分散未解离的组织块，离心弃上清；
6、(4)酶解产物加入胰蛋白酶进行二次消化解离，主要是将未消化的组织块进行彻底解离；
7、(5)终止酶消化反应，对酶解产物进行机械吹打以分散未解离的组织块；
8、(6)酶解产物过细胞网筛并离心，获得细胞沉淀，清洗并重悬细胞沉淀，获得细胞悬液；
9、(7)细胞悬液中加入红细胞裂解液进行裂红；
10、(8)裂红产物过细胞网筛，离心，加入细胞清洗液清洗后，重悬获得单细胞悬液。
11、优选的，所述混合酶解离液中含有胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶v，透明质酸酶、分散酶ii和dnasei六种酶。
12、优选的，所述胶原酶i的工作浓度为0.5～1mg/ml，胶原酶ii的工作浓度为1.5～2.5mg/ml，胶原酶v的工作浓度为1.0～1.5mg/ml，透明质酸酶的工作浓度为1～2mg/ml，分散酶ii的工作浓度为0.125～0.25mg/ml，dnase i的工作浓度为20-40u/ml。
13、优选的，所述混合酶解液使用基础培养基或含ca2+、mg2+的hbss缓冲液溶解，基础培养基为dmem/f12或rpm1640。
14、优选的，步骤(2)中混合酶解离液与组织块的体积比为5～10:1，酶解温度为37℃，酶解时间为0.5-1h，在恒温摇床上孵育操作。
15、优选的，步骤(1)具体为在超净工作台中使用冰预冷的1x pbs对小鼠内脏组织清洗至少3遍，去除组织表面的血丝和多余的脂肪。然后使用手术剪刀将组织剪碎成大小在0.5～2mm3的方块，继续用1x pbs清洗2～3遍。
16、优选的，步骤(4)中使用的胰蛋白酶为无血清培养基和0.25％ trypsin-edta按1:1比例等体积混合而成。
17、优选的，步骤(4)中胰蛋白酶加入的体积为1～5ml，酶解温度为37℃，酶解时间为5-15min在恒温摇床上孵育操作。
18、优选的，步骤(5)中使用含10％血清的完全培养基终止反应，然后用吸管反复吹打酶解产物30-50次。
19、优选的，步骤(6)中使用70μm细胞网筛过筛；离心条件为300-500g离心5min；采用基础培养基对细胞沉淀进行清洗重悬。
20、优选的，步骤(7)中红细胞裂解液与细胞悬液体积比为3:1。
21、优选的，步骤(8)中使用40μm细胞网筛过筛，离心条件为300-500g离心5min；细胞清洗液为含0.04％～0.5％ bsa的1x dpbs缓冲液。
22、本专利技术提供了一种高效的组织解离单细胞悬液制备的方法，使用新型的混合酶解离液，优化了配方和各组分配比，其中加入的分散酶ii对细胞特别温和，可大大降低解离过程对细胞造成的损伤，而加入的dnasei可以消化游离的dna，减少细胞之间的黏连，降低细胞结团率。同时也简化了制备流程，缩短了制备时间，可以获得高活性的单细胞悬液，悬液杂质少，污染低，非常适合高通量单细胞测序和细胞系的培养，为细胞生物学和功能基因组学研究奠定基础。
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1.一种从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于其步骤包括：
2.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于所述混合酶解离液中含有胶原酶I、胶原酶II、胶原酶V，透明质酸酶、分散酶II和DNaseI六种酶。
3.根据权利要求2所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于所述胶原酶I的工作浓度为0.5～1mg/ml，胶原酶II的工作浓度为1.5～2.5mg/ml，胶原酶V的工作浓度为1.0～1.5mg/ml，透明质酸酶的工作浓度为1～2mg/ml，分散酶II的工作浓度为0.125～0.25mg/ml，DNase I的工作浓度为20-40U/ml。
4.根据权利要求2所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于所述混合酶解液使用基础培养基或含Ca2+、Mg2+的HBSS缓冲液溶解，基础培养基为DMEM/F12或RPM1640。
5.根据权利要求2所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(2)中混合酶解离液与组织块的体积比为5～10:1，酶解温度为
6.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(1)具体为在超净工作台中使用冰预冷的1x PBS对小鼠内脏组织清洗至少3遍，去除组织表面的血丝和多余的脂肪。然后使用手术剪刀将组织剪碎成大小在0.5～2mm3的方块，继续用1x PBS清洗2～3遍。
7.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(4)中使用的胰蛋白酶为无血清培养基和0.25％Trypsin-EDTA按1:1比例等体积混合而成。
8.根据权利要求5所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(5)中胰蛋白酶加入的体积为1～5ml，酶解温度为37℃，酶解时间为5-15min在恒温摇床上孵育操作。
9.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(5)中使用含10％血清的完全培养基终止反应，然后用吸管反复吹打酶解产物30-50次。
10.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(6)中使用70μm细胞网筛过筛；离心条件为300-500g离心5min；采用基础培养基对细胞沉淀进行清洗重悬。
11.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(7)中红细胞裂解液与细胞悬液体积比为3:1。
12.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(8)中使用40μm细胞网筛过筛，离心条件为300-500g离心5min；细胞清洗液为含0.04％～0.5％BSA的1x DPBS缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于其步骤包括：
2.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于所述混合酶解离液中含有胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶v，透明质酸酶、分散酶ii和dnasei六种酶。
3.根据权利要求2所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于所述胶原酶i的工作浓度为0.5～1mg/ml，胶原酶ii的工作浓度为1.5～2.5mg/ml，胶原酶v的工作浓度为1.0～1.5mg/ml，透明质酸酶的工作浓度为1～2mg/ml，分散酶ii的工作浓度为0.125～0.25mg/ml，dnase i的工作浓度为20-40u/ml。
4.根据权利要求2所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于所述混合酶解液使用基础培养基或含ca2+、mg2+的hbss缓冲液溶解，基础培养基为dmem/f12或rpm1640。
5.根据权利要求2所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(2)中混合酶解离液与组织块的体积比为5～10:1，酶解温度为37℃，酶解时间为0.5-1h，在恒温摇床上孵育操作。
6.根据权利要求1所述的从小鼠内脏组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于步骤(1)具体为在超净工作台中使用冰预冷的1x pbs对小鼠内脏组织清洗至少3遍，去除组织表面的血丝和多余的脂肪...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹振，常明星，刘珊珊，王晓琴，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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