【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种牛结节性皮肤病病毒环状rna和疫苗的制备及其应用，具体涉及一种编码牛结节性皮肤病病毒优化的lsdv122、优化的lsdv141、优化的lsdv117和优化的lsdv060的环状rna分子组合的制备及应用；包含编码牛结节性皮肤病病毒优化的lsdv122、优化的lsdv141、优化的lsdv117、优化的lsdv060的环状rna、线性rna、重组质粒、重组大肠杆菌工程菌，以及环状rna的制备方法及应用。
技术介绍
1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)是一种由牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，lsdv)引起的高度传染性疫病。1929年lsd首次发现于非洲的赞比亚，我国首次确诊的lsd病例发生在2019年8月新疆，之后在多个省份报道发病。lsd典型特征是在皮肤上形成结节，导致牛皮受损，造成产奶量下降、流产、不育等，少数发病牛最终因严重感染死亡，还因牛的流动和贸易限制造成间接损失，对养牛业产生重大经济影响。该病被世界动物卫生组织列为必须报告的牛疫病之一，我国农业农村部将其列为二类动物疫病。
2、lsdv属于痘病毒科，与山羊痘病毒(goatpox virus,gtpv)和绵羊痘病毒(sheeppox virus,sppv)均为山羊痘病毒属。lsdv大小约为290nm×270nm，lsdv感染细胞时主要以细胞外包膜病毒(extracellular enveloped virus，eev)和细胞内成熟病毒(intracellular ma
3、根据国家动物疫病免疫技术指南，目前我国推荐接种5倍剂量的山羊痘活疫苗来预防牛结节性皮肤病。但弱毒活疫苗具有致病的风险，近年来已发现牛结节病毒活疫苗株和野毒株发生重组的报道(doi：10.1371/journal.pone.0207480)。接种灭活疫苗安全，但灭活疫苗在制造过程中有病毒扩散的风险，因此制造成本、质量控制和生产工艺要求均较高。因此需要开发更安全、高效同时成本可控的新型牛结节性皮肤病病毒疫苗。
4、rna疫苗是将含有编码抗原蛋白的rna直接导入机体，使其在体内直接翻译，完成目标蛋白的表达，从而引起机体特异的免疫反应，已在人重大呼吸道传染病的预防方面发挥重要作用。目前在临床或临床前应用的rna主要为线性rna，与线性rna相比，环状rna分子往往具有较长的半衰期，具有更好的稳定性，在蛋白表达、临床治疗中具有重要的应用前景。
5、针对lsdv的rna疫苗等新型疫苗的研究较为困难：病毒结构复杂，基因组较大编码至少156个orf，且具有多层囊膜结构，各囊膜上分别具有多个不同蛋白，难以选择合适的疫苗靶点。m.naveed(doi：10.26355/eurrev_202307_33000)和sehrish kakakhel(doi：10.3390/bioengineering10040430)等分别使用通过生物信息学方法预测的lsdv的毒性t细胞表位、辅助t细胞表位和b细胞表位设计了相应的rna分子并进行了分子制备，但并均未能评价免疫效果。lsdv、gtpv和sppv基因高度同源，min zheng等尝试构建了针对gtpv的dna分子组合(doi:10.1016/j.virol.2009.05.031)，编码a27(对应lsdv117)、l1(对应lsdv060)、a33(对应lsdv122)、b5(对应lsdv141)蛋白组合，该分子组合在小鼠体内免疫效果和攻毒保护效果均优于山羊痘活疫苗，提示可能是lsdv疫苗研究有效靶点。但直接使用该组野生型蛋白存在问题：(1)a27、l1、a33、b5蛋白均为膜蛋白或者膜相关蛋白，表达有难度，如a33蛋白在体外表达时以包涵体存在，导致抗原的免疫原性低(doi:10.3390/v8060159)。(2)min zheng等构建dna疫苗编码野生型a27、l1、a33、b5蛋白组合在小鼠体内效果好，但在羊体内攻毒保护效果差。该分子组合在羊体内的产生的抗体滴度、细胞免疫应答均较低，低于山羊痘活疫苗，可能是在羊体内效果不好的重要原因。因此设计牛结节性皮肤病病毒rna疫苗需首先解决的问题包括：设计牛结节性皮肤病病毒rna分子在牛体细胞中可高效率表达目标蛋白；疫苗在本动物牛体内能诱导高水平体液免疫应答和细胞免疫应答。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供一种牛结节性皮肤病病毒环状rna和疫苗的制备及其应用。解决了用野生型蛋白和公开方法设计环状rna分子目标蛋白表达量低，对应疫苗产生病毒抗体水平低、细胞免疫应答弱的问题，为制备预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的rna疫苗提供基础。所述环状rna编码表达牛结节性皮肤病病毒优化的lsdv122蛋白、优化的lsdv141蛋白、优化的lsdv117蛋白、优化的lsdv060蛋白。本专利技术优选的环状rna分子提高目标蛋白在牛细胞中表达量，用环状rna分子制备的疫苗成功激发牛体内产生高水平抗体并激活高水平细胞免疫反应，为制备预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的rna疫苗提供基础
2、本专利技术提供的技术方案如下：
3、<环状rna>
4、所述环状rna包含以下环状rna分子中的至少一种：编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv122蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv141蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv117蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv060蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv122蛋白优化获得的lsdv122-1蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv141蛋白优化获得的lsdv141-1蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv117蛋白优化获得的lsdv117-1蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv060蛋白优化获得的lsdv060-1蛋白的环状rna分子；
5、所述牛结节性皮肤病病毒lsdv122蛋白的氨基酸序列包含如seq id no.3所示的序列，或与seq id no.3所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有lsdv122蛋白活性的序列；
6、所述牛结节性皮肤病病毒lsdv141蛋白的氨基酸序列包含如seq id no.5所示的序列，或与seq id no.5所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有lsdv141蛋白活性的序列；
7、所述牛结节性皮肤病病毒lsdv117蛋白的氨基酸序列包含如seq id no.7所示的序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA包含以下环状RNA分子中的至少一种：编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白优化获得的LSDV122-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白优化获得的LSDV141-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白优化获得的LSDV117-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白优化获得的LSDV060-1蛋白的环状RNA分子；
2.根据权利要求1所述的环状RNA，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的环状RNA，其特征在于，所述环状RNA包含如下(a)～(d)中任一项所示排列次序的元件：
4.根据权利要求1所述的环状RNA，其特征在于：所述环状RNA包括如下环状RNA分子组
5.根据权利要求4所述的环状RNA，其特征在于：
6.一种包含如权利要求1-5中任一项所述的环状RNA的牛结节性皮肤病病毒疫苗。
7.一种根据权利要求6所述牛结节性皮肤病病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
8.一种线状RNA，其特征在于，所述线状RNA发生自剪切反应后环化形成如权利要求1-5中任一项所述的环状RNA。
9.一种重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子转录后形成如权利要求8所示的线状RNA。
10.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为如权利要求9所述的重组核酸分子转化E.coli而得。
11.一种如权利要求1-5中任一项所述的环状RNA；或如权利要求6所述的牛结节性皮肤病病毒疫苗；或如权利要求7所述的牛结节性皮肤病病毒疫苗的制备方法；或如权利要求8所述的线状RNA；或如权利要求9所述的重组核酸分子；或如权利要求10所述的重组大肠杆菌工程菌在制备用于预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种环状rna，其特征在于，所述环状rna包含以下环状rna分子中的至少一种：编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv122蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv141蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv117蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv060蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv122蛋白优化获得的lsdv122-1蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv141蛋白优化获得的lsdv141-1蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv117蛋白优化获得的lsdv117-1蛋白的环状rna分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒lsdv060蛋白优化获得的lsdv060-1蛋白的环状rna分子；
2.根据权利要求1所述的环状rna，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的环状rna，其特征在于，所述环状rna包含如下(a)～(d)中任一项所示排列次序的元件：
4.根据权利要求1所述的环状rna，其特征在于：所述环状rna包括如...
【专利技术属性】
技术研发人员：仲从浩，殷波，翟伟锋，刘纯西，左炽健，张震，聂文豪，
申请(专利权)人：上海申锐联生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。