【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，尤其涉及一种构建含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体的方法及应用。
技术介绍
1、气味遗传学技术是继光遗传学和化学遗传学之后全新细胞操控技术，由于该技术兼具光遗传学的可开/关属性和时-空时间分辨性以及化学遗传学的简单易用性的优点，因此具有极大的发展潜力。而气味受体在蜜蜂嗅觉系统中对气味分子的特殊识别中起着至关重要的作。目前西方蜜蜂(apis mellifera)中的气味受体11(amor11)已被证明与蜂王的9-氧代-2-癸烯酸(9-oda)特异性结合。
2、而且基于光遗传学和化学遗传学设计包含特异性受体的载体，在细胞中的调控过于强烈，这使得光遗传学和化学遗传学对细胞的生理效应影响过于强烈，因此引入气基于气味遗传技术的载体构建技术，以避免光遗传学和化学遗传学技术所构建的载体对细胞的生理效应的影响强烈，是目前亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、本申请提供了一种构建含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体的方法及应用，以解决现有技术中传统的光遗传学和化学遗传学技术所构建的载体对细胞的生理效应的影响强烈的技术问题。
2、第一方面，本申请提供了一种构建含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体的方法，所述方法包括：
3、分别对含9-氧代-2-癸烯酸受体的受体载体和腺相关病毒载体采用内切酶进行酶切，分别得到受体载体酶切片段和病毒载体酶切片段；
4、回收所述受体载体酶切片段和所述病毒
5、对所述重组质粒载体进行质粒dna扩增，得到质粒扩增产物；
6、采用脂质体法包装所述质粒扩增产物，并转染目标细胞，后进行病毒的表达和浓缩纯化，得到含9-氧代-2-癸烯酸受体的腺病毒原液；
7、对所述腺病毒原液进行滴度检测，判断腺病毒的滴度是否符合使用标准；
8、若是，则保存所述腺病毒原液，得到含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体；
9、其中，所述受体载体和所述腺相关病毒载体的酶切位点相同。
10、进一步地，所述采用脂质体法包装所述质粒扩增产物，并转染目标细胞，后进行病毒的表达和浓缩纯化，得到含9-氧代-2-癸烯酸受体的腺病毒原液，具体步骤包括：
11、混合dna溶液和脂质体溶液并第一静置，得到脂质体混合物；
12、对目标细胞进行预处理，向处理后的目标细胞培养基中滴加所述脂质体混合物和所述质粒扩增产物，并进行第二静置，得到连接产物；
13、移除所述连接产物中含有dna-脂质体复合物的培养基，并加入含目标细胞的培养液进行转染，后收集含腺病毒的上清液；
14、离心所述上清液并进行过滤，后进行离心浓缩，得到含9-氧代-2-癸烯酸受体的腺病毒。
15、进一步地，所述第一静置的时间≥20min；和/或，
16、所述第二静置的时间为6h～10h。
17、进一步地，所述收集的时刻为所述转染后48h和72h。
18、进一步地，所述过滤所用滤膜的孔径≤0.45μm。
19、进一步地，对所述腺病毒原液进行滴度检测，判断腺病毒的滴度是否符合使用标准，具体包括：
20、对所述腺病毒原液采用梯度稀释法感染目标细胞，并检测稀释后所述腺病毒原液中9-氧代-2-癸烯酸受体的基因拷贝数；
21、根据所述基因拷贝数和所述梯度稀释法的稀释倍数，计算腺病毒原液的滴度；
22、根据所述腺病毒原液的滴度和目标滴度的大小，判断腺病毒的滴度是否符合使用标准；
23、若所述腺病毒原液的滴度≤所述目标滴度，则保存腺病毒原液，得到含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体；
24、若所述腺病毒原液的滴度＞所述目标滴度，则重新进行浓缩纯化。
25、进一步地，所述酶切位点包括xbai和bamhi。
26、进一步地，所述受体载体包括pcmv-amor11载体；和/或，
27、所述腺相关病毒载体包括paav-ef1α-ires-gfp载体。
28、第二方面，本申请提供了一种含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体，所述真核表达腺病毒载体由第一方面所述的方法制备得到。
29、第三方面，本申请提供了一种第二方面所述的真核表达腺病毒载体的应用，将第二方面所述的真核表达腺病毒载体用于对非诊断和治疗目的人体生理活动的调控中。
30、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
31、本申请实施例提供的一种构建含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体的方法采用相同的内切酶对含有9-氧代-2-癸烯酸受体的受体载体和含有腺病毒的腺病毒相关载体分别进行酶切，再回收酶切片段并进行连接，从而能简便的得到含有9-氧代-2-癸烯酸受体的腺病毒载体，再进行dna扩增和包装，能保证该腺病毒载体完成真核表达的过程，再对表达出的腺病毒原液进行滴度判定，能保证表达出的腺病毒的纯度、安全性和有效性符合安全使用的标准，从而得到含有气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体，相比光遗传学和化学遗传学技术构建载体的过程，该方法可以得到纯净的含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的载体，从而可以利用腺病毒载体中气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体对细胞的生理效应进行合理的调控，避免对细胞生理效应的影响过于强烈。
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1.一种构建含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用脂质体法包装所述质粒扩增产物，并转染目标细胞，后进行病毒的表达和浓缩纯化，得到含9-氧代-2-癸烯酸受体的腺病毒原液，具体步骤包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一静置的时间≥20min；和/或，
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述收集的时刻为所述转染后48h和72h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述过滤所用滤膜的孔径≤0.45μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述腺病毒原液进行滴度检测，判断腺病毒的滴度是否符合使用标准，具体包括：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位点包括XBaI和BamHI。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受体载体包括pCMV-AmOR11载体；和/或，
9.一种含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体，
10.一种如权利要求9所述的真核表达腺病毒载体的应用，其特征在于，将如权利要求9所述的真核表达腺病毒载体用于对非诊断和治疗目的人体生理活动的调控中。
...【技术特征摘要】
1.一种构建含气味分子9-氧代-2-癸烯酸受体的真核表达腺病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用脂质体法包装所述质粒扩增产物，并转染目标细胞，后进行病毒的表达和浓缩纯化，得到含9-氧代-2-癸烯酸受体的腺病毒原液，具体步骤包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一静置的时间≥20min；和/或，
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述收集的时刻为所述转染后48h和72h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述过滤所用滤膜的孔径≤0.45μm。
6.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：项红兵，刘成，李星，田学愎，周志强，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：
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