【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利涉及一种突变型t4 dna连接酶、其编码dna、试剂盒及其在文库构建中的应用，属于生物。
技术介绍
1、随着生命科学的发展，我们需要分析多物种的遗传信息，ngs又称高通量测序，可以一次性读取几十万到几百万条dna分子的序列，能提供丰富的遗传学信息。而ngs的首要步骤是文库制备，文库制备对于ngs工作流程至关重要。该步骤会制备出兼容测序仪的dna或rna样本。一般的文库构建通常会先将dna进行片段化，然后将片段化后的dna末端补平，再在补平后的dna片段的3’端加a，5’端进行磷酸化，最后向dna片段两端添加特定的接头来构建测序文库。
2、接头和dna片段最初通过a/t碱基互补完成配对，然后在连接酶的催化作用下，dna片段和接头的5’-磷酸末端和3’-羟基末端之间形成磷酸二酯键，达到稳定的连接。因此稳定高效的连接酶，对ngs测序显得尤为重要。
3、t4 dna连接酶（t4 dna ligase）是由t4噬菌体30基因编码的一类双链dna连接酶，可以催化相邻dna链的5’-磷酸末端和3’-羟基末端形成磷酸二酯键的反应，利用这一特性，t4 dna连接酶广泛被用于基因工程的各个领域，包括基因克隆、高通量测序和高通量筛选等。
4、由于t4 dna连接酶的反应底物通常是经过酶切处理的，所以难免会在连接反应中残留上一步反应的离子，但通常，野生型（wt）t4 dna连接酶的反应条件温和，对热敏感，稳定性低，容易失活。高盐、高温都会使其酶活受到抑制甚至会造成不可逆的失活。因此，一款高效高稳定性的t
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种用于文库构建的高效的突变型t4 dna连接酶，具有更高的连接效率。
2、本专利技术采用的技术方案为：一种突变型t4 dna连接酶，在野生型t4 dna 连接酶的基础上，至少具有下述的六个氨基酸位点突变：s14d（第14位的丝氨酸突变为天冬氨酸）、q19i（第19位的谷氨酰胺突变为异亮氨酸）、s40y（第40位的丝氨酸突变为酪氨酸）、v108f（第108位的缬氨酸突变为苯丙氨酸）、q133m（第133位的谷氨酰胺突变为甲硫氨酸）、n357p（第357位的天冬酰胺突变为脯氨酸），以及下述三个突变位点中0~3个突变位点：a85p（第85位的丙氨酸突变为脯氨酸）、v169i（第169位的缬氨酸突变为异亮氨酸）、d480m（第480位的天冬氨酸突变为甲硫氨酸）；其中野生型t4 dna连接酶的氨基酸序列如seq id no.10所示。所述突变型t4 dna连接酶的氨基酸序列如seq id no.1-8中任一项所示。
3、其中效果最佳的突变型t4 dna连接酶为：在野生型t4 dna连接酶基础上，具有下述的氨基酸位点突变：s14d、q19i、s40y、a85p、v108f、q133m、v169i、n357p、d480m，其氨基酸序列如seq id no：8所示，其编码dna序列如seq id no：9所示。
4、该突变型t4 dna连接酶的反应温度为15℃~45℃，突变型t4 dna连接酶的反应buffer中的离子浓度为50~350mm。
5、本专利技术还公开了上述的突变型t4 dna连接酶在连接dna片段中的应用，以及文库构建中的应用。
6、本专利技术还公开了一种dna连接试剂盒，包含上述的突变型t4 dna连接酶。
7、本专利技术还公开了一种核酸建库试剂盒，包含上述的突变型t4 dna连接酶。
8、本专利技术还公开了一种快速dna建库试剂盒，试剂盒包括：
9、片段化末修加a试剂；
10、接头连接试剂，其中接头连接试剂包括前述的突变型t4 dna连接酶；
11、文库扩增试剂。
12、优选的，所述片段化末修加a试剂包含多种酶及其反应buffer的混合物，其中的酶包含片段化酶、末端修复酶、磷酸激酶及dna聚合酶。
13、优选的，所述片段化末修加a试剂的反应温度为30℃~40℃，反应时间为3~30min。
14、优选的，所述片段化末修加a试剂包括nacl、mgcl2，每种浓度为50~350mm。
15、优选的，所述片段化末修加a试剂中mgcl2浓度300mm，nacl浓度200mm。
16、优选的，所述接头连接试剂为突变型t4 dna连接酶与其反应buffer的混合物。
17、优选的，接头连接试剂中盐离子浓度为50~350mm。
18、优选的，接头连接试剂的反应温度为15℃~45℃。
19、优选的，突变型t4 dna连接酶的使用量为1000u~5000u。
20、优选的，所述文库扩增试剂为高保真dna聚合酶与其反应buffer的混合物。
21、本专利技术的快速的稳定的核酸建库试剂盒中的片段化试剂、文库扩增试剂，可以采用翌圣生物的hieff ngs® onepot pro dna library prep kit v2（cat.12195）一步法dna建库试剂盒组分。
22、本专利技术的突变型t4 dna连接酶具有更高的连接效率，用于建库时，可以提高文库产量。其中的突变型t4 dna连接酶8更是具有耐盐和热稳定的特性，对盐浓度敏感性低，可无需纯化，直接承接多种酶切或者末端修复反应。本专利技术的突变型t4 dna连接酶8对温度敏感性低，可在室温存放4周，活性无明显下降，使其反应和储存条件更加宽松，更加稳定。本专利技术的快速的稳定的核酸建库试剂盒，只有三种组分，使用更方便，自动化仪器适配性高，2.5h可以实现任意（0.1ng~2ug）投入量建库，满足多种高通量测序建库的需求。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种突变型T4 DNA连接酶，其特征为：在野生型T4 DNA 连接酶的基础上，至少具有下述的六个氨基酸位点突变：S14D、Q19I、S40Y、V108F、Q133M、N357P，还包括A85P、V169I、D480M中的0~3个突变位点，其中野生型T4 DNA连接酶的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
2.根据权利要求1所述的突变型T4 DNA连接酶，其特征为：所述突变型T4 DNA连接酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1~8中任一项所示。
3.根据权利要求1或2所述的突变型T4 DNA连接酶，其特征在于所述突变型T4 DNA连接酶的反应温度为15℃~45℃，所述突变型T4 DNA连接酶的反应Buffer中的离子浓度为50~350mM。
4.权利要求1-3中任一项所述的突变型T4 DNA连接酶的编码DNA。
5.根据权利要求4所述的编码DNA，其特征在于其序列如SEQ ID No.9所示。
6.权利要求1-3中任一项所述的突变型T4 DNA连接酶在连接DNA片段中的应用。
7.权利要求1-3中任
8.一种DNA连接试剂盒，其特征在于包括权利要求1-3中任一项所述的突变型T4 DNA连接酶。
9.一种核酸建库试剂盒，其特征在于包括权利要求1-3中任一项所述的突变型T4 DNA连接酶。
10.一种快速DNA建库试剂盒，其特征在于试剂盒包括：
11.根据权利要求10所述的快速DNA建库试剂盒，其特征在于所述片段化末修加A试剂包含多种酶及其反应buffer的混合物，其中的酶包含片段化酶、末端修复酶、磷酸激酶及DNA聚合酶。
12.根据权利要求10所述的快速DNA建库试剂盒，其特征在于所述接头连接试剂为突变型T4 DNA连接酶与其反应buffer的混合物。
13.根据权利要求10所述的快速DNA建库试剂盒，其特征在于所述文库扩增试剂为高保真DNA聚合酶与其反应buffer的混合物。
...【技术特征摘要】
1.一种突变型t4 dna连接酶，其特征为：在野生型t4 dna 连接酶的基础上，至少具有下述的六个氨基酸位点突变：s14d、q19i、s40y、v108f、q133m、n357p，还包括a85p、v169i、d480m中的0~3个突变位点，其中野生型t4 dna连接酶的氨基酸序列如seq id no.10所示。
2.根据权利要求1所述的突变型t4 dna连接酶，其特征为：所述突变型t4 dna连接酶的氨基酸序列如seq id no.1~8中任一项所示。
3.根据权利要求1或2所述的突变型t4 dna连接酶，其特征在于所述突变型t4 dna连接酶的反应温度为15℃~45℃，所述突变型t4 dna连接酶的反应buffer中的离子浓度为50~350mm。
4.权利要求1-3中任一项所述的突变型t4 dna连接酶的编码dna。
5.根据权利要求4所述的编码dna，其特征在于其序列如seq id no.9所示。
6.权利要求1-3中任一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹振，杨春玲，刘娜，李麦麦，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。