【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物合成，特别涉及一种维生素mk-4的生物酶法制备工艺。
技术介绍
1、维生素k对于维护骨骼健康、预防心血管疾病以及免疫调节等方面具有重要作用。维生素k有三个类型，分别是k1、k2和k3，在人体内，维生素k1和k3必须转化为k2才能被人体吸收。维生素k2本身也分为几个不同的亚型，包括mk-4、mk-6、mk-7和mk-8，它们之间是根据化学结构上异戊二烯侧链长度不同进行分类。其中mk-4是其中比较重要的一类维生素k2，市场需求广泛，具有巨大的药用价值。
2、目前mk-4主要的工业制备方法有两种，一种是化学合成法，另一种是生物发酵法。化学合成法是最普遍应用的mk-4工业合成方案，生物发酵法则是以产黄杆菌作为发酵菌株经过发酵后分离纯化获得mk-4。
3、1979年化学合成法相关报道的整体反应以2-甲基萘为原料，经过氧化、溴化、还原、保护以及金属试剂加侧链和去保护氧化成mk-2，该反应首次在最后一步用硝酸铈铵脱除甲氧基氧化成醌，但该方法最终产物杂质较多，难以纯化。到了2003年，mk-4的化学合成路线得到了改进，通过砜基作用使两个短链连接，从而获得目的产物，但是在脱除矾基过程中会发生一定数目双键迁移。该方法路线也是目前工业上化学合成mk-4的主流生产工艺，目前国内企业主要采用化学法合成mk-4。
4、日本在1980年开始进行mk-4的微生物发酵生产尝试，主要是采用产黄杆菌进行自然发酵获得mk-4产品。通过对发酵菌株进行不断的优化筛选，时至今日mk-4的发酵生产产率仅为0.5%，而微生物
5、化学法合成mk-4主要采用烯丙基配合物为起始物料，经过十几步反应获得维生素k2，均使用金属催化剂引入侧链，成本较贵，后处理复杂；也有的合成路线采用苯并四元环酮作为核心步骤，反应步骤超过20步，关键中间体有剧毒，金属氧化剂以及保护剂等对环境污染较大；另有一些反应过程需要添加culi以及其他保护剂，反应条件较为苛刻，另外需要额外添加卤素试剂，后处理成本高。
6、目前工业上化学法合成维生素mk-4的过程中，主要有三个关键技术环节，每个环节都存在瓶颈和技术难点。第一个关键技术环节是醌官能团的保护，在化学法合成mk-4的早期研究中，一般直接用萘醌和烷基化试剂反应，由于醌在反应中结构不稳定，结果都不理想，后期进行改进后使用甲氧基作为保护剂进行基团保护，但是甲氧基也存在脱除困难的问题，而继续改进改为采用氧化银或硝酸铈作氧化剂，发现副产物较多，收率不高。目前仍然没有寻找到合适的保护基团。
7、第二个关键技术环节是反应过程中母核与侧链的连接问题，目前工业上采用两种主流方法实现母核与侧链连接：f-c烷基化和格氏反应。烷基化反应要求酸性条件，会使不饱和侧链发生成环反应，并且在萘环2位和3位存在反应性特异性低的问题，会产生大量异构体，有一部分侧链会由反式异构成顺式结构，失去生物活性。格氏反应虽然可以避免烷基化的相关弊端，但是萘环结构的格氏试剂制备较为困难，反应的引发也是一个难点。
8、第三个关键技术环节是侧链全反式结构的保持，对于维生素mk-4，只有全反式侧链才具有生物活性。目前的相关烷基化方法均不利于全反式结构的保持，导致产出无生物活性的产品。
9、对于微生物发酵法生产mk-4，与化学合成法相比，微生物发酵法具有污染低，操作简便等优点，但目前微生物发酵法生产mk-4的缺点也很明显，主要有以下几点：（1）产率低，日本经过40多年的优化选育，最高报道产率仅为0.5%；（2）发酵周期较长，为6~7天；（3）菌株优化改进方法繁杂且周期很长，日本对菌株的优化改进策略采用传统的自然诱变筛选，该优化方法费时费力，筛选周期非常长，往往需要几十年时间进行不断的选育；（4）无法获得mk-4纯品，因为产黄杆菌本身也产mk-6，发酵完后所获得的是mk-4和mk-6混合物，无法快速高效将两种物质分离开，因此发酵法所获得的mk-4均是含有mk-6杂质的混合物，以上种种弊端导致mk-4的成本居高不下。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种维生素mk-4的生物酶法制备工艺，大大缩短了合成路线，同时采用廉价原料作为出发底物，大大降低了mk-4的生产成本，且兼具生物法的相关优势比如污染少、操作简便等。相比于化学合成法和传统的微生物发酵法，本专利技术在产率和生产成本方面具有极大优势，另外本专利技术的新生物合成路线所得mk-4产品并不掺杂有mk-6，产品纯度高，减少了后续分离纯化的难度。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种维生素mk-4的生物酶法制备工艺，包括以下步骤：
4、（1）二甲基烯丙基二磷酸的合成：异戊烯醇在羟乙基噻唑激酶（ec 2.7.1.50，ncbigene id: 945142）催化下生成二甲基烯丙基单磷酸（dmap）；二甲基烯丙基单磷酸（dmap）在磷酸异戊烯基激酶（ec 2.7.4.26，ncbi gene id: 1450882）催化下生成二甲基烯丙基二磷酸（dmapp）；
5、（2）异戊烯基二磷酸的合成：异戊二烯醇在羟乙基噻唑激酶（ec 2.7.1.50）催化下生成异戊烯基单磷酸（ip）；异戊烯基单磷酸（ip）在磷酸异戊烯基激酶（ec 2.7.4.26）催化下生成异戊烯基二磷酸（ipp）；
6、（3）香叶酰香叶酰二磷酸的合成：二甲基烯丙基二磷酸和异戊烯基二磷酸在法尼酰二磷酸合酶（ec 2.5.1.10，ncbi gene id: 945064）催化下生成香叶酰香叶酰二磷酸；
7、（4）mk-4的合成：香叶酰香叶酰二磷酸和维生素k3一起在香叶酰香叶酰转移酶（ec2.5.1.m22，ncbi gene id: hs04454）催化下生成目标产物mk-4。
8、本专利技术主要解决了两个关键技术问题：1.解决了目前微生物发酵法mk-4生物合成路线过长导致的产率过低的难题，通过通路重新设计大大缩短mk-4的生物合成路线，有效地提高了产率；2.解决了目前微生物发酵法生产mk-4时掺杂有mk-6杂质的问题，本专利技术通过更换催化反应的相关酶，使最终产物只有mk-4，而没有mk-6的生成。进而，本专利技术
技术实现思路
有望应用于工业规模生产mk-4。
9、本专利技术通过四步酶法催化即可获得mk-4。本反应体系共涉及5个酶，其中一个酶是参与建立辅因子atp循环体系，其余四个酶参与合成mk-4的催化过程。由于更换了最后一步催化反应的酶，与日本的微生物发酵法相比，本专利技术并不会产生mk-6杂质。
10、作为优选，步骤（1）和步骤（2）中，添加atp作为辅因子和提供能量。
11、作为优选，所述atp由atp循环系统提供，atp循环系统包括adp激酶、循环启动用atp和焦磷酸钠。
12、作为优选，所述atp由atp循环系统生成，atp循环系统包括adp激酶、循环启动用atp和焦磷酸钠，其中adp激酶浓度为0.1~10m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种维生素MK-4的生物酶法制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）中，添加ATP作为辅因子并提供能量。
3.根据权利要求2所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：所述ATP由ATP循环系统提供，ATP循环系统包括ADP激酶、循环启动用ATP和焦磷酸钠，其中ADP激酶浓度为0.1~10mg/L，循环启动用ATP初始添加浓度为50~1000mg/L，焦磷酸钠初始添加浓度为50~1000mg/L，在酶促反应温度下进行循环，焦磷酸钠每隔1.5~2小时补加一次。
4.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（1）中，酶促反应体系各原料添加量为：底物异戊烯醇1~100mL/L，羟乙基噻唑激酶0.5~50mg/L，磷酸异戊烯基激酶0.5~50mg/L；催化反应温度为20~40℃，pH控制在6-8。
5.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（2）中，酶促反应体系各原料添加量为：底物异戊二烯醇1~100mL/L，羟乙基噻唑激酶0.5~50mg/
6.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（3）中，酶促反应体系各原料添加量为：二甲基烯丙基二磷酸和异戊烯基二磷酸的总用量为1~100g/L，其中二甲基烯丙基二磷酸和异戊烯基二磷酸的质量比为1:1~1:3，法尼酰二磷酸合酶的用量为0.5~50mg/L；催化反应温度为20~40℃，pH控制在6-8。
7.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（4）中，还添加有抗坏血酸，酶促反应体系各原料添加量为：香叶酰香叶酰二磷酸1~200g/L，维生素K3 1~40g/L，抗坏血酸0.1~5g/L，香叶酰香叶酰转移酶0.5~50mg/L；催化反应温度为20~40℃，pH控制在6-8，全程避光。
8.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：香叶酰香叶酰二磷酸和维生素K3的质量比为1:1~5:1。
9.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（1）至步骤（4）中，酶促反应所用的缓冲体系为磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
10.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（1）至步骤（4）中使用的酶采用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母中的一种工程菌株表达生产。
...【技术特征摘要】
1.一种维生素mk-4的生物酶法制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）中，添加atp作为辅因子并提供能量。
3.根据权利要求2所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：所述atp由atp循环系统提供，atp循环系统包括adp激酶、循环启动用atp和焦磷酸钠，其中adp激酶浓度为0.1~10mg/l，循环启动用atp初始添加浓度为50~1000mg/l，焦磷酸钠初始添加浓度为50~1000mg/l，在酶促反应温度下进行循环，焦磷酸钠每隔1.5~2小时补加一次。
4.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（1）中，酶促反应体系各原料添加量为：底物异戊烯醇1~100ml/l，羟乙基噻唑激酶0.5~50mg/l，磷酸异戊烯基激酶0.5~50mg/l；催化反应温度为20~40℃，ph控制在6-8。
5.根据权利要求1所述的生物酶法制备工艺，其特征在于：步骤（2）中，酶促反应体系各原料添加量为：底物异戊二烯醇1~100ml/l，羟乙基噻唑激酶0.5~50mg/l，磷酸异戊烯基激酶0.5~50mg/l；催化反应温度为20~40℃，ph控制在6-8。
【专利技术属性】
技术研发人员：罗志波，吴彦，曲茂华，
申请(专利权)人：杭州微远生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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