增强的病毒样颗粒及使用其递送至细胞的方法技术

一种增强的病毒样颗粒(eVLP)，其包括：在外侧的、包含具有一种或多种源自病毒的糖蛋白的磷脂双层的膜；和在膜的内侧的、配置在eVLP的核心的载物，其中eVLP不包含外源性gag/pol蛋白，以及使用其将载物递送至细胞的方法。以及使用其将载物递送至细胞的方法。以及使用其将载物递送至细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增强的病毒样颗粒及使用其递送至细胞的方法
[0001]优先权要求
[0002]本申请要求于2020年7月24日提交的美国临时专利申请系列号63/056,125的权益。前述申请的全部内容通过引用在此并入本文。
[0003]联邦资助的研究或开发
[0004]本专利技术由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号GM118158在政府的支持下完成。美国政府享有本专利技术的某些权利。


[0005]本文中描述了增强的病毒样颗粒(eVLP)，其包括：在外侧的、包含具有一种或多种源自病毒的糖蛋白的磷脂双层的膜；和在膜的内侧的、配置在eVLP的核心的载物(cargo)，其中eVLP不包含来自任何人内源性或外源性病毒gag或pol的蛋白，以及使用其将载物递送至细胞的方法。

技术介绍

[0006]例如蛋白质、核酸和/或化学物质等载物向活细胞的胞质溶胶中的递送已是生物治疗学的发展中的一项重大障碍。

技术实现思路

[0007]本文中描述了增强的病毒样颗粒(eVLP)，其能够将多种多样的有效负载物(payload)，例如，包括核酸(DNA、RNA)或蛋白质的生物分子、包括小分子的化学化合物、和/或其它分子、及其任意组合包装和递送至真核细胞中。本文中描述的非病毒eVLP系统具有比传统的人工衍生的脂质/金纳米颗粒和基于病毒颗粒的递送系统更简单、更有效和更安全的潜能，这至少因为，除了ENV以外，eVLP不具有源自病毒的组分，eVLP可以利用但是不需要基于化学物质的二聚体，并且eVLP具有包装和递送以下物质的能力：特殊的(specialty)单链和/或双链DNA分子(例如，质粒、微环、封闭末端线性DNA、AAV DNA、附加体、噬菌体DNA、同源定向修复模板等)、单链和/或双链RNA分子(例如，单向导RNA、引导编辑(prime editing)向导RNA、信使RNA、转移RNA、长链非编码RNA、环状RNA、RNA复制子、环状或线性剪接RNA、微小RNA、小干扰RNA、短发夹RNA、piwi相互作用RNA、支点开关RNA、可以由RNA结合蛋白结合的RNA、噬菌体RNA、含有RNA的内部核糖体进入位点等)、蛋白质、化学化合物和/或分子，以及以上列出的载物的组合(例如AAV颗粒)。本文中描述的eVLP不同于传统的逆转录病毒颗粒、病毒样颗粒(VLP)、外泌体(exosome)和其它先前描述的可负载有载物的细胞外囊泡，这是因为膜构成、很多不同的可能的载物(借助新型、创新性负载策略而使其成为可能)、缺少限制性DNA/RNA长度约束、缺少源自任何病毒gag或pol的蛋白质、和细胞进入的机制。
[0008]本文中描述了用于载物递送的组合物和方法，其可与多种多样的蛋白质和核酸分子，包括适用于许多疾病疗法的基因组编辑试剂、表观基因组调节试剂、转录组编辑试剂和
蛋白质组调节试剂一起使用。
[0009]因此，本文中提供了eVLP，其包括：在外侧的、包含具有一种或多种源自病毒的糖蛋白(例如，如表1中所示)的磷脂双层的膜；和任选在膜的内侧的、配置在eVLP的核心的载物，其中eVLP不包含任何gag和/或pol蛋白。
[0010]本文中还提供了用于将载物递送至靶细胞例如体内细胞或体外细胞的方法。该方法包括使细胞与包含生物分子和/或化学物质作为载物的如本文中所述的eVLP接触。
[0011]此外，本文中提供了用于生产例如包含生物分子载物的eVLP的方法。该方法包括提供表达一种或多种源自病毒的糖蛋白(ENV)(例如，如表1中所示)、和载物生物分子和/或化学物质的细胞，其中该细胞不表达外源性gag和/或pol蛋白；和将该细胞维持在使该细胞生产eVLP的条件下。
[0012]在一些实施方案中，该方法包括收获和任选地纯化和/或浓缩生产的eVLP。
[0013]在一些实施方案中，该方法包括使用这样的细胞，其已经过或未经过操作以表达除了ENV(例如，如表1中所示)以外的任何外源性蛋白，和根据需要的细胞质膜募集结构域(例如，如表6中所示)。在该实施方案中，通过利用与载物混合的纯化颗粒的核转染、脂质、聚合物、或CaCl2转染、超声处理、冻融和/或热冲击，所生产的“空”颗粒可负载有载物。在所有实施方案中，生产者细胞不表达任何病毒gag蛋白。这种类型的负载允许载物通过与细胞质膜募集结构域的融合而不被修饰，并且显示与先前的VLP技术相比的重大进步。
[0014]本文中还提供表达一种或多种源自病毒的糖蛋白(例如，如表1中所示)和载物的细胞，其中该细胞不表达外源性gag蛋白。在一些实施方案中，该细胞为原代或稳定的人细胞系，例如，人胚肾(HEK)293细胞或HEK293 T细胞。
[0015]在一些实施方案中，颗粒的外表面可以包含scFv、纳米抗体、darpins和/或其它靶向肽以使细胞特异性进入成为可能。
[0016]在一些实施方案中，生物分子载物为治疗性蛋白质或诊断性蛋白质或者编码治疗性蛋白质或诊断性蛋白质的核酸。
[0017]在一些实施方案中，载物为化学化合物或分子。
[0018]在一些实施方案中，化学分子是蛋白质
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蛋白质二聚化或多聚化的触发器，例如A/C异二聚物或雷帕霉素。
[0019]在一些实施方案中，化学化合物为DNA PK抑制剂，例如有效地增强同源定向修复基因编辑的M3814、NU7026或NU7441。
[0020]在一些实施方案中，载物为基因编辑试剂。
[0021]在一些实施方案中，基因编辑试剂包含锌指(ZF)、转录激活因子样效应物(TALE)、和/或基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白；编码锌指(ZF)、转录激活因子样效应物(TALE)、和/或基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白的核酸；或包含基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白的核糖核蛋白复合体(RNP)。
[0022]在一些实施方案中，基因编辑试剂选自表2、3、4和5中列出的蛋白质。
[0023]在一些实施方案中，基因编辑试剂包含基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白，并且eVLP进一步包含一种或多种向导RNA，所述向导RNA结合至基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白，并且将基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白引导至靶序列。
[0024]在一些实施方案中，载物包含与细胞质膜募集结构域、优选如表6中所示的细胞质
膜募集结构域的共价或非共价连接。共价连接，例如，可包括从单一阅读框产生的直接的蛋白质
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蛋白质融合、可形成肽键的内含肽、可在R基团和/或RNA剪接处形成共价连接的其它蛋白质。非共价连接，例如，可包括DNA/DNA、DNA/RNA和/或RNA/RNA杂交体(核酸通过氢键相互作用与其它核酸碱基配对)、需要或不需要化学化合物/分子诱导蛋白质
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蛋白质结合的二聚化或多聚化的蛋白结构域、单链可变片段、纳米抗体、亲和体、与DNA和/或RNA结合的蛋白质、具有四级结构相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种增强的病毒样颗粒(eVLP)，其包括：在外侧的、包含具有一种或多种源自病毒的糖蛋白、任选如表1中所示的糖蛋白的磷脂双层的膜；和在所述膜的内侧的、配置在eVLP的核心的载物，其中所述eVLP不包含外源性gag和/或pol蛋白。2.根据权利要求1所述的eVLP，其中所述载物为治疗性蛋白质或诊断性蛋白质或者编码治疗性蛋白质或诊断性蛋白质的核酸、或者化学物质、任选地治疗性小分子或诊断性小分子。3.根据权利要求1所述的eVLP，其中所述载物为基因编辑试剂。4.根据权利要求1所述的eVLP，其中所述基因编辑试剂包含锌指(ZF)、转录激活因子样效应物(TALE)、和/或基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白；编码锌指(ZF)、转录激活因子样效应物(TALE)、和/或基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白的核酸；或包含基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白的核糖核蛋白复合体(RNP)。5.根据权利要求4所述的eVLP，其中所述基因编辑试剂选自表2、3、4和5中列出的蛋白质。6.根据权利要求4所述的eVLP，其中所述基因编辑试剂包含基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白，并且所述eVLP进一步包含一种或多种向导RNA，所述向导RNA结合至所述基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白，并且将所述基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白引导至靶序列。7.根据权利要求1
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6所述的eVLP，其中所述载物包含与细胞质膜募集结构域、优选如表6中所示的细胞质膜募集结构域的融合物。8.一种将载物递送至靶细胞的方法，所述靶细胞任选为体内细胞或体外细胞，所述方法包括使所述细胞与包含所述载物的权利要求1
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7所述的eVLP接触。9.一种生产包含载物的eVLP的方法，所述方法包括：提供表达一种或多种源自病毒的糖蛋白(任选如表1中所示)和载物的细胞，其中所述细胞不表达外源性gag和/或pol蛋白；和将所述细胞维持在使所述细胞生产eVLP的条件下。10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括收获和任选地纯化和/或浓缩生产的eVLP。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述载物为治疗性蛋白质或诊断性蛋白质或者编码治疗性蛋白质或诊断性蛋白质的核酸、或者小分子、任选地治疗性小分子或诊断性小分子。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述载物为基因编辑试剂。13.根据权利要求9所述的方法，其中所述基因编辑试剂包含锌指(ZF)、转录激活因子样效应物(TALE)、和/或基于CRI...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：哈佛大学，
类型：发明
国别省市：