人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法。包括以下步骤：(1)将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304

【技术实现步骤摘要】
人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]精氨酸酶(L
‑
Arginase)，又称L
‑
精氨酸尿素水解酶，催化L
‑
精氨酸生成鸟氨酸和尿素。精氨酸酶广泛分布在不同生物体内，如哺乳动物、爬行动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌类等。在哺乳动物中，目前发现有两种不同基因编码序列的精氨酸酶，其中：精氨酸酶I(Arginase I)主要位于哺乳动物肝脏器官的细胞质中，司职于尿素循环最后一步反应；精氨酸酶II(Arginase II)是一种线粒体酶，大量存在于尿素循环以外的机体组织中，其主要作用是调控平衡细胞中精氨酸/鸟氨酸的浓度。
[0003]目前国内外市场中精氨酸酶多是来源于动物脏器，Bach等人从牛肝中提取并纯化了精氨酸酶。但是近年来，由于朊病毒等一些病原微生物的存在，造成了某些人畜共患病的隐患，使动物来源的药物酶在应用于人体时受到极大的限制。
[0004]考虑到以上诸多因素，用基因工程的方法表达人精氨酸酶基因是使其能应用于生物医药领域的首选之策。人精氨酸酶I在1990年实现了原核表达，但受限于当时表达体系的发展水平，研究者采用的启动子无论是表达水平还是非诱导条件下控制转录的能力都有待提高。南京理工大学在2006年尝试了在毕赤酵母工程菌中表达人精氨酸酶I，但表达的蛋白没有分泌到酵母细胞外，表达量也偏低。复旦大学李益鹏等在2015年将获得的人精氨酸酶I全长cDNA克隆至原核高表达载体，通过自动诱导系统进行人肝脏精氨酸酶I的表达，重组人精氨酸酶I的产量为每升菌液48.5mg，其纯度超过95％。
[0005]上述利用基因工程表达人精氨酸酶I的表达系统多集中于大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统，但还未见有基于枯草芽孢杆菌表达体系生产人重组精氨酸酶I的相关报道。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法。本专利技术首次采用枯草芽孢杆菌体系构建了人重组精氨酸酶I生产菌，显著提高了人重组精氨酸酶I的表达量和活性。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种人重组精氨酸酶I生产菌的构建方法，包括以下步骤：
[0009](1)将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304
‑
Pg3；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304
‑
Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304
‑
Pg3上，获得重组表达载体(pHT304
‑
Pg3
‑
arg1)；
[0010](2)将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。
[0011]优选的，步骤(1)中，对arg1基因进行了优化改造处理，首先将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，基于突变后的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列重新获得了编码核苷酸序列，并进行了密码子优化；然后在优化后的核苷酸序列中增加了一段信号肽序列，并插入了凝血酶酶切位点和10个His尾巴。最终优化改造处理后的arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0012]优选的，步骤(1)中，Pg3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]优选的，步骤(1)中，质粒pHT304
‑
Pg3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]优选的，步骤(1)中，重组表达载体(pHT304
‑
Pg3
‑
arg1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0015]本专利技术的第二方面，提供上述方法构建得到的人重组精氨酸酶I生产菌。
[0016]本专利技术的第三方面，提供上述人重组精氨酸酶I生产菌在如下(1)或(2)中的应用：
[0017](1)发酵生产人重组精氨酸酶I；
[0018](2)发酵生产鸟氨酸。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020](1)为实现人重组精氨酸酶I的体外表达，本专利技术对现有的表达系统进行了筛选考察，结果发现，枯草芽孢杆菌表达系统虽然也为原核表达系统，但是，与大肠杆菌等原核表达表达系统相比，利用枯草芽孢杆菌表达人重组精氨酸酶I，其更有利于蛋白的折叠、修饰。
[0021](2)基于枯草芽孢杆菌表达系统，本专利技术选择pHT304质粒作为基础质粒，并对其进行了改造，将Pg3启动子整合到pHT304质粒，Pg3启动子只有在加入IPTG后才开始表达，因此，将启动子进行替换后，菌株前期生长快，进入稳定期所需时间短，进而提高了人重组精氨酸酶I的表达量。
[0022](3)本专利技术还对人重组精氨酸酶I进行了定点突变处理，使突变后的人重组精氨酸酶I的活性得到显著提高；并对编码突变后人重组精氨酸酶I的核苷酸序列进行了密码子优化处理、增加信号肽、凝血酶酶切位点、组氨酸尾巴等一系列的优化处理，提高了人重组精氨酸酶I的表达量，而且方便后续的纯化处理。
附图说明
[0023]图1：质粒pHT304
‑
Pg3的结构示意图。
[0024]图2：人精氨酸酶I的三维结构示意图。
[0025]图3：野生型精氨酸酶I(W
‑
Arginase1)与突变型精氨酸酶I((R
‑
Arginase1)的蛋白主链的均方根偏差(RMSD)曲线。
[0026]图4：不同浓度DMSO存在时对突变前后精氨酸酶I催化反应初始速率的影响。
[0027]图5：arg1基因优化前的密码子相对适应度。
[0028]图6：arg1基因优化后的密码子相对适应度。
[0029]图7：本专利技术构建的重组表达载体(pHT304
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Pg3
‑
arg1)的结构示意图。
[0030]图8：本专利技术构建的重组表达载体(pHT304
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Pg3
‑
arg1)的电泳验证。
[0031]图9：本专利技术构建的人重组精氨酸酶I生产菌的菌落PCR验证。
[0032]图10：本专利技术构建的人重组精氨酸酶I生产菌的western blot验证；图中，右侧泳道为Marker。
具体实施方式
[0033]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0034]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人重组精氨酸酶I生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304
‑
Pg3；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304
‑
Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304
‑
Pg3上，获得重组表达载体；(2)将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，Pg3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹华杰，谢沛，岳明瑞，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：