L-鸟氨酸生产菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种L

【技术实现步骤摘要】
L
‑
鸟氨酸生产菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种L
‑
鸟氨酸生产菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]L
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鸟氨酸(L
‑
ornithine)是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，在生物体内，是尿酸循环的中间产物，对维持体内的氮平衡有重要作用。近年来，鸟氨酸的应用日益广泛，如在医药上可以与精氨酸一起用作保肝、强身、解毒剂类药剂的原料，在食品上可用于配制恢复疲劳的发泡饮料，其需求量也随之不断上升。
[0003]采用微生物发酵法制备L
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鸟氨酸为近年来主要采用的制备工艺之一，它大大拓宽了L
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鸟氨酸来源，推动了L
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鸟氨酸的研究和应用。目前的相关研究主要集中在菌种选育和培养基优化上。其中，对于L
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鸟氨酸生产菌株的研究，Shukuo Kinoshita等首先利用紫外、氰化物等传统的诱变技术，获得了谷氨酸棒杆菌瓜氨酸缺陷型突变株，成功的积累了L
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鸟氨酸。R.J.Plachy等人选育了谷氨酸棒杆菌L
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Arg
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和D
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Arg
r
的突变株进行发酵，获得了较好的效果，发酵液中积累的L
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鸟氨酸达30g/L。
[0004]传统的诱变育种技术在L
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鸟氨酸菌种改造上获得了极大的成功，但由于其突变的随机性，增加了育种的不确定性。用基因工程技术对菌种进行改造是技术发展的方向。但由于L
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鸟氨酸是瓜氨酸和精氨酸生物合成的中间体，其代谢调控过程复杂，L
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鸟氨酸难以有效积累。因此，通过基因工程技术构建L
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鸟氨酸生产菌仍是目前的技术难点所在。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种L
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鸟氨酸生产菌及其构建方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种L
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鸟氨酸生产菌的构建方法，包括以下步骤：
[0008](1)将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；
[0009](2)将pQE
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N质粒用AccⅢ和sphⅠ双酶切，再将argA基因整合到双酶切处理后的质粒pQE
‑
N上，获得重组表达载体(pQE
‑
argA)；
[0010](3)将步骤(2)获得的重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L
‑
鸟氨酸生产菌。
[0011]优选的，步骤(1)中，基因敲除的顺序为：先敲除poxB、pta、ptsG、argI基因，再敲除sucA、sucB基因，最后敲除iclR、aceA和aceB基因。
[0012]上述敲除顺序的好处为：先敲除poxB、pta、ptsG、argI基因，增加EMP途径
→
TCA循环的流量；若直接敲除TCA循环中的基因，菌种延滞期会很长，传代时间长，导致构建工程菌的时间增加。另外，在敲除sucA、sucB基因以及iclR、aceA和aceB基因之后，如果菌株长的慢，可以在培养基中加入0.1g/L的琥珀酸，以提高菌株生长速度。因此，采用上述敲除顺序，可以极大缩短大肠杆菌工程菌的构建时间。
[0013]本专利技术虽然敲除了大肠杆菌的多个基因，但对大肠杆菌的生长并未产生明显的负面影响，这主要是因为：本专利技术选择敲除的基因均不是持家基因，故敲除后虽然延滞期稍有增加，但不会对菌种的生长造成影响。而且通过转种时间和补料，也能缩短延滞期的持续时间。此外，每次敲除之后都会进行传代培养，基本上三
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四代后，菌种由于其适应性，菌种会适应这种被敲除基因的状态，初代培养时生长速度缓慢的情况会有明显改善。
[0014]优选的，步骤(2)中，质粒pQE
‑
N的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]步骤(2)中，argA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；作为优选，在将argA基因整合到质粒pQE
‑
N前进行密码子优化和添加酶切位点处理，处理后的argA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。argA基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016]优选的，步骤(2)中，所述重组表达载体(pQE
‑
argA)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]本专利技术的第二方面，提供上述方法构建得到的L
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鸟氨酸生产菌。
[0018]本专利技术的第三方面，提供上述L
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鸟氨酸生产菌在发酵生产L
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鸟氨酸中的应用。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020](1)本专利技术在构建L
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鸟氨酸生产菌时，首先对L
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鸟氨酸代谢途径进行综合分析，通过使用基因敲除方法对EMP途径、三羧酸循环、尿素循环等代谢途径进行了改造，使得更多的碳源流向L
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鸟氨酸，从而显著提高了L
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鸟氨酸的产量。具体来说：
[0021]本专利技术分别敲除了：
[0022]ptsG基因，其编码葡萄糖糖
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磷酸转移酶系统II(Glucose phosphotransferase system,PtsG)，通过敲除ptsG基因，能够阻止PEP和Glc生成Pyr，并且阻止葡萄糖的不均衡代谢。
[0023]poxB基因，编码丙酮酸脱氢酶(Pyruvate oxidase，PoxB)，通过敲除poxB基因，能够阻止Pyr生成Acetate。
[0024]Pta基因，编码磷酸转乙酰基酶(Phosphotransacetylase，Pta)，过敲除Pta基因，能够阻止乙酰coA生成Acetate。
[0025]iclR基因，编码异柠檬酸裂解酶阻遏物(aceBAKoperon repressor，IclR)，过敲除iclR基因，能够阻止异柠檬酸走向分支。
[0026]通过敲除aceA基因(编码isocitrate lyase)和aceB(malate synthase A)基因，能够阻止异柠檬酸生成苹果酸。
[0027]sucA基因编码[subunit of E1(0)component of 2
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oxoglutarate dehydrogenase]、sucB基因编码(dihydrolipoyltranssuccinylase)，通过敲除sucA和sucB基因，能够阻止α
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酮戊二酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
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鸟氨酸生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；(2)将pQE
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N质粒用AccⅢ和sphⅠ双酶切，再将argA基因整合到双酶切处理后的质粒pQE
‑
N上，获得重组表达载体；(3)将步骤(2)获得的重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L
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鸟氨酸生产菌。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，基因敲除的顺序为：先敲除poxB、pta、ptsG、argI基因，再敲除sucA、sucB基因，最后敲除iclR、aceA和aceB基因。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹华杰，岳明瑞，谢沛，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：