一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质。该标准物质是利用MS2噬菌体装甲RNA技术，将新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因用MS2噬菌体的衣壳蛋白包装而成，本发明专利技术制备的标准物质具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，适用于新冠病毒以ORF1ab基因、E基因和N基因为靶标的核酸检测方法的质量控制，以及检测试剂和实验室能力的评价。以及检测试剂和实验室能力的评价。以及检测试剂和实验室能力的评价。

【技术实现步骤摘要】
一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用


[0001]本专利技术属于疫病检测
，特别涉及一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用。

技术介绍

[0002]当前，新型冠状病毒肺炎疫情在全球范围内大流行，截止2021年12月7日，全球累计确诊超过2亿7千万人，累计死亡超过532万人，全球每日新增确诊仍保持在60万人左右。因此全球对它高度关注，虽然各国对新冠肺炎防制策略不尽相同，但都把新冠肺炎的快速诊断和及时监测作为首要步骤。核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为新冠病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。
[0003]新型冠状病毒为RNA病毒，其成熟的病毒体为多形态有囊膜的颗粒，直径75～160nm，基因组为单股正链RNA，冠状病毒拥有已知最大的RNA病毒基因组，其衣壳呈20面立体对称，囊膜表面有约20nm长的棒状或花瓣状刺突，形状似日冕。新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因是新冠核酸检测的主要靶基因。目前，国内外针对新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因建立了多种核酸检测方法，其中应用最多是荧光RT
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PCR方法，市场上也有多种不同厂家生产的核酸检测试剂盒，这些试剂盒在检测特异性、灵敏度等方面均有不同，直接影响检测结果的一致性和准确性。此外，目前新型冠状病毒核酸检测方法和试剂使用的质控样品多选择质粒DNA和体外转录cRNA制备，裸露核酸又极易被广泛存在的核酸酶降解，且不能实现核酸提取过程的有效监控，难以保证检测结果的准确性。因此，研制一种既稳定又没有传染性可用于新型冠状病毒核酸检测的质控样品和标准物质对于其检测方法和试剂的标准化、规范化使用及临床检测具有重要意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于克服现有质控样品或标准物质的不足，利用MS2噬菌体装甲RNA技术，制备了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质，该标准物质具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，可用于多种新型冠状病毒核酸检测方法和试剂盒的质量控制。本专利技术主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0005]一方面，本专利技术提供了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质，该装甲RNA标准物质的原核表达载体包括pET32a
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ACP
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ORF1ab质粒、pET32a
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ACP
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E质粒和pET32a
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ACP
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N质粒，将表达载体转入表达菌株中，诱导表达，得到内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒；
[0006]其中原核表达载体pET32a
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ACP
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ORF1ab质粒、pET32a
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ACP
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E质粒和pET32a
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ACP
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N质粒中，所述ACP序列为如序列表SEQ ID NO：4所示的包含MS2噬菌体基因组5'非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的序列，所述
ORF1ab基因、E基因和N基因序列如序列表SEQ ID NO：1～3所示。
[0007]另一方面，本专利技术还提供了一种一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备方法，包括以下步骤：
[0008]1)获得用于新冠病毒核酸检测的ORF1ab基因、E基因和N基因序列；
[0009]2)将包含MS2噬菌体基因组5'非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的序列克隆于原核表达载体pET32a中，分别在其下游插入通过步骤1)获得的ORF1ab基因、E基因和N基因的cDNA序列，获得表达载体pET32a
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ACP
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ORF1ab、pET32a
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ACP
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E、pET32a
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ACP
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N；
[0010]3)将原核表达载体转入表达菌株中，诱导表达，然后采用超声波裂解，离心，收集上清液，获得表达产物；
[0011]4)经Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化，去除残留质粒DNA，得到内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒；
[0012]5)将内含新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因的装甲RNA病毒样颗粒通过荧光定量RT
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PCR方法定值，稀释混合分装，即得。
[0013]优选的，步骤4)中，具体过程为：取平衡缓冲液平衡Cellufine sulfate树脂柱，将表达产物上柱结合，用洗涤缓冲液I洗脱，再用洗脱缓冲液II洗脱，收集含装甲RNA病毒颗粒的溶液；然后用固体聚乙二醇进行沉淀，再利用DNase I消化残留的质粒DNA，得到内含新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒，其中，平衡缓冲液为含有0.1M氯化钠的浓度为10mM的磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗涤缓冲液I为含0.3M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗脱缓冲液II为含2M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5。
[0014]优选的，内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质中质粒DNA的残留量为0。
[0015]优选的，内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的浓度为106copies/μL。
[0016]再一方面，本专利技术还提供了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质在制备新冠病毒核酸检测试剂中的应用。
[0017]本专利技术的积极进步效果在于：
[0018]1)该装甲RNA内部包含的ORF1ab基因、E基因和N基因片段，覆盖了目前多数新型冠状病毒核酸检测方法和试剂盒检测的区域，如WHO和CDC荐的新型冠状病毒荧光RT
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PCR检测方法等。因此该标准物质可用于现有新型冠状病毒核酸检测方法和试剂的质量控制。
[0019]2)该装甲RNA标准物质纯度高，无质粒DNA残留，具有良好的质控性能。装甲RNA VLPs的表达产物中会混杂有大量的细菌蛋白、核酸以及质粒DNA，如果不去除将直接影响到质控样品的性能，特别是质粒DNA，未经核酸提取和反转录过程即可检测为阳性，即便只有微量残留，在指数级扩增后也会对结果构成显著影响。研究中，我们试图通过超速离心、病毒沉淀以及DNase消化的方法纯化VLPs，结果发现残留质粒DNA均无法彻底去除。为此，我们进行了多种方法的尝试，包括硅粉吸附、超速离心以及Cellufine Sulfate亲和层析法等试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质，其特征在于，该装甲RNA标准物质的原核表达载体包括pET32a
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ACP
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ORF1ab质粒、pET32a
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ACP
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E质粒和pET32a
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ACP
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N质粒，该表达载体通过转入表达菌株中，诱导表达后得到内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒；其中原核表达载体pET32a
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ACP
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ORF1ab质粒、pET32a
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ACP
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E质粒和pET32a
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ACP
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N质粒中的ACP序列为序列表SEQ ID NO：4所示的包含MS2噬菌体基因组5'非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的序列，所述ORF1ab基因、E基因和N基因序列对应序列表SEQ ID NO：1～3所示。2.一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得用于新冠病毒核酸检测的ORF1ab基因、E基因和N基因序列；2)将包含MS2噬菌体基因组5'非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的序列克隆于原核表达载体pET32a中，分别在其下游插入通过步骤1)获得的ORF1ab基因、E基因和N基因的cDNA序列，获得表达载体pET32a
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ACP
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ORF1ab、pET32a
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ACP
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E、pET32a
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AC...

【专利技术属性】
技术研发人员：任彤，汪琳，高志强，蒲静，赵相鹏，尹羿，张伟，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：