一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化酶法生产L

【技术实现步骤摘要】
一种固定化酶法生产L
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鸟氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及氨基酸生产
，具体涉及一种固定化酶法生产L
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鸟氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
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鸟氨酸(L
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ornithine)是生物体内普遍存在的氨基酸之一。1877年杰弗在喂养安息香酸的鸟类的尿液水解产物中发现了鸟氨酸，由此得名。在动物体内，鸟氨酸主要参与尿素循环，L
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鸟氨酸作为产生尿素的中间产物，参与了瓜氨酸、精氨酸等氨基酸的新陈代谢，尤其是在鸟氨酸循环中起到重要作用，能够在很大程度上促进体内氨的排出以起到解毒作用，所以对于人体的肝脏细胞来说，L
‑
鸟氨酸是非常重要的。在医学上，L
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鸟氨酸也具有广泛的应用，在氨基酸保健品家族中具有重要的地位和广阔的市场前景，直接参与了抗菌性药物的生物或化学合成。
[0003]现有制备L
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鸟氨酸的方法主要有提取法、化学法、微生物发酵法和酶法。其中，提取法制备L
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鸟氨酸的成本太高，且提供工艺繁琐，现已很少报道；化学法合成鸟氨酸，原料来源广泛且成本低，但该法经过多步化学反应合成，收率偏低，且合成出的鸟氨酸为DL型混合物，产物的手性拆分亦给该工艺增加了难度和成本；微生物发酵法制备L
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鸟氨酸是近年来主要采用的制备工艺之一，用发酵法生产鸟氨酸原料成本低廉，但产量不高；酶法生产鸟氨酸是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸生成鸟氨酸和尿酸。酶法生产L
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鸟氨酸专一性强，反应条件温和，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离，但精氨酸酶的来源不易，底物精氨酸的成本也较高。
[0004]对于酶法生产L
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鸟氨酸，张鹏等利用粪肠球菌体内的精氨酸酶转化生产L
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鸟氨酸，最高产量达112g/L，转化率达99.5％。但是，其生产过程是利用游离细胞转化底物L
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精氨酸，转化液中会含有少量菌体蛋白和其他杂质，不利于产物的分离纯化。因此，游离细胞转化不利于工业化连续生产，酶的利用率也不高。针对于此，专利CN 1661026A、专利CN 102286563A提出了固定化酶制备L
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鸟氨酸的方法，但是，上述现有技术固定精氨酸酶采用的是固定化载体包埋或者利用自制的纤维素微球载体吸附，其必然会减少精氨酸酶与底物的接触面积，从而降低了酶的催化效率。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种固定化酶法生产L
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鸟氨酸的方法。本专利技术首先构建了一种新的人重组精氨酸酶I生产菌，并对发酵工艺进行了优化，显著提高了发酵生产人重组精氨酸酶I的产量和酶活；然后将发酵生产的人重组精氨酸酶I采用镍柱挂柱对酶进行固定化处理；再流加底物液进行转化处理，从而实现了固定化酶法生产L
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鸟氨酸，提高了转化率。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种固定化酶法生产L
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鸟氨酸的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32
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34℃，pH为6.8
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7.2，溶氧(DO)为20
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40％，搅拌转速180
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220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.50
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0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20
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28h；
[0009]培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5
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1g/L；
[0010](2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1
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7.3，进行破菌处理；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8
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12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱；
[0011](3)将含有L
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精氨酸的底物溶液流经步骤(2)挂柱后的镍柱进行生物转化，收集流出的转化液，即生产得到L
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鸟氨酸。
[0012]优选的，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：
[0013]将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304
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Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304
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Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304
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Pg3上，获得重组表达载体(pHT304
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Pg3
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arg1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
[0014]将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。
[0015]更优选的，对arg1基因进行了优化改造处理，首先将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，基于突变后的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列重新获得了编码核苷酸序列，并进行了密码子优化；然后在优化后的核苷酸序列中增加了一段信号肽序列，并插入了凝血酶酶切位点和10个His尾巴。最终优化改造处理后的arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0016]优选的，步骤(1)中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。
[0017]优选的，步骤(1)中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。
[0018]优选的，步骤(2)中，镍柱亲和层析的条件为：以50mM的PBS作为结合缓冲液，将滤液挂柱。
[0019]优选的，步骤(3)中，所述底物溶液中含有：L
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精氨酸50g/L，磷酸吡哆醛1mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1mg/L。
[0020]优选的，步骤(3)中，底物溶液的流速为3m3/h。
[0021]优选的，步骤(3)中，生物转化的条件为：转化温度25℃
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45℃，pH7.2
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7.3。
[0022]更优选的，生物转化的温度为37℃，pH7.25。
[0023]本专利技术的有益效果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶法生产L
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鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32
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34℃，pH为6.8
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7.2，溶氧为20
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40％，搅拌转速180
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220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.50
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0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20
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28h；培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5
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1g/L；(2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1
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7.3，进行破菌处理；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8
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12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱；(3)将含有L
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精氨酸的底物溶液流经步骤(2)挂柱后的镍柱进行生物转化，收集流出的转化液，即生产得到L
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鸟氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304
‑
Pg3...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹华杰，谢沛，岳明瑞，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：