一种发酵生产人重组精氨酸酶I的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产人重组精氨酸酶I的方法，包括以下步骤：(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产人重组精氨酸酶I的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种发酵生产人重组精氨酸酶I的方法。

技术介绍

[0002]精氨酸酶I(Arginase I)主要位于哺乳动物肝脏器官的细胞质中，是尿素循环中的一种酶，可催化精氨酸水解产生鸟氨酸和尿素，在机体氮代谢方面起着重要作用。精氨酸作为一种半必需氨基酸，仅为快速增长的组织，尤其是肿瘤组织所必需。而精氨酸酶I通过分解精氨酸对肿瘤细胞进行营养剥夺，对正常组织影响较小；众多体内外实验证明，精氨酸酶I有着显著的抑制肿瘤细胞分裂的作用，因此，精氨酸酶I是一种良好的抗肿瘤药物，具有广阔的市场应用前景。
[0003]人源酶因其抗原性低，是医药用酶的首选。人精氨酸酶I在1990年实现了原核表达，但受限于当时表达体系的发展水平，研究者采用的启动子无论是表达水平还是非诱导条件下控制转录的能力都有待提高。南京理工大学在2006年尝试了在毕赤酵母工程菌中表达人精氨酸酶I，但表达的蛋白没有分泌到酵母细胞外，表达量也偏低。复旦大学李益鹏等在2015年将获得的人精氨酸酶I全长cDNA克隆至原核高表达载体，通过自动诱导系统进行人肝脏精氨酸酶I的表达，重组人精氨酸酶I的产量为每升菌液48.5mg，其纯度超过95％。
[0004]但上述研究大多仍停留在实验室水平，且重组人精氨酸酶I的产量偏低，若将其应用于工业化生产，由于规模放大效应的影响，很难实现满意的发酵生产重组人精氨酸酶I的效果。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种发酵生产人重组精氨酸酶I的方法。本专利技术通过改造人重组精氨酸酶I生产菌和优化发酵生产工艺，显著提高了发酵生产人重组精氨酸酶I的产量和酶活。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种发酵生产人重组精氨酸酶I的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32
‑
34℃，pH为6.8
‑
7.2，溶氧(DO)为20
‑
40％，搅拌转速180
‑
220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.50
‑
0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20
‑
28h；
[0009]培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5
‑
1g/L；
[0010](2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1
‑
7.3，过均质机破碎；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8
‑
12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱，然后加入牛凝血酶溶液进行切割，用生理盐水洗脱，收集洗脱液；将洗脱液过苯甲脒
‑
琼脂糖凝胶树脂，除去牛凝血酶；将过完苯
甲脒
‑
琼脂糖凝胶树脂的洗脱液再过Sephadex G
‑
150葡聚糖凝胶，收集收集3h
‑
8h流出的液体；收集的液体通过电渗析进行脱盐，收集淡水，浓缩、干燥，即生产得到人重组精氨酸酶I。
[0011]优选的，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：
[0012]将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304
‑
Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304
‑
Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304
‑
Pg3上，获得重组表达载体(pHT304
‑
Pg3
‑
arg1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
[0013]将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。
[0014]更优选的，对arg1基因进行了优化改造处理，首先将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，基于突变后的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列重新获得了编码核苷酸序列，并进行了密码子优化；然后在优化后的核苷酸序列中增加了一段信号肽序列，并插入了凝血酶酶切位点和10个His尾巴。最终优化改造处理后的arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0015]优选的，步骤(1)中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。
[0016]优选的，步骤(1)中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。
[0017]优选的，步骤(2)中，加入牛凝血酶溶液进行切割的具体条件为：消化缓冲液采用150mM NaCl，pH7.0，消化温度30℃，切割10h。
[0018]优选的，步骤(2)中，电渗析的条件为：pH控制在7.25，温度控制在40℃以下；淡室电导≤1000μs/cm时，关闭电渗析，将淡水放出。
[0019]优选的，步骤(2)中，干燥采用冷冻干燥，冷冻干燥的条件为：
[0020]预冻：每分钟温度降低15℃，降至
‑
35℃；速冻：制冷板层
‑
40℃，放入制品机器全速制冷，等待2h开始抽真空；升华干燥：真空值控制在10
‑
30Pa；解析干燥：缓慢升温至+40℃，真空值小于20Pa；关闭冻干箱与冷凝器之间的真空阀门，观察60s，若压力上升小于0.5Pa，冻干结束。
[0021]本专利技术的第二方面，提供上述方法生产得到的人重组精氨酸酶I，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023]为提高发酵生产人重组精氨酸酶I的产量和酶活，实现工业化生产，本专利技术从酶定点突变处理、菌株构建和发酵工艺优化三个方面进行了研究。具体来说：
[0024](1)本专利技术首先采用分子动力学模拟的方法对人重组精氨酸酶I进行了结构优化，将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸。突变后的人重组精氨酸酶I的酶活与野生型人重组精氨酸酶I相比，有了显著的提高。
[0025](2)针对突变处理后的人重组精氨酸酶I，本专利技术进一步构建了相应的生产菌株，选择pHT304质粒作为基础质粒，并对其进行了改造，将Pg3启动子整合到pHT3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产人重组精氨酸酶I的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32
‑
34℃，pH为6.8
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7.2，溶氧为20
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40％，搅拌转速180
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220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.50
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0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20
‑
28h；培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5
‑
1g/L；(2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1
‑
7.3，过均质机破碎；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8
‑
12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱，然后加入牛凝血酶溶液进行切割，用生理盐水洗脱，收集洗脱液；将洗脱液过苯甲脒
‑
琼脂糖凝胶树脂，除去牛凝血酶；将过完苯甲脒
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琼脂糖凝胶树脂的洗脱液再过Sephadex G
‑
150葡聚糖凝胶，收集收集3h
‑
8h流出的液体；收集的液体通过电渗析进行脱盐，收集淡水，浓缩、干燥，即生产得到人重组精氨酸酶I。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304
‑
Pg3，其核苷酸序列如SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹华杰，岳明瑞，谢沛，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：