精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法，包括以下步骤：(1)对Pg3启动子进行优化，将质粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将优化后的Pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pHT304上，得到质粒pHT304

【技术实现步骤摘要】
精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]胍基丁胺(Agmatine)又称为鲱精胺，分子式C5H
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N4，一种内源性可乐定置换物质(clonidine displacing substance,CDS)，是咪唑啉受体的激动剂α2‑
肾上腺素能受体的非儿茶酚胺配体。它存在于生物体多种组织和细胞中,在生物体代谢中起到重要作用，具有多种生物学功能。在心血管系统，胍基丁胺能降低心率、平均动脉压、左室压、外周血管阻力指数等；在泌尿系统，胍基丁胺能增加肾小球过滤率和绝对近端冲吸收；在胃肠道，胍丁胺能增加胃酸和胃蛋白酶的分泌，使粘膜厚度变薄，恶化应激引起的粘膜病变等；在糖代谢条件中，胍丁胺能增加胰岛素的分泌，此外，近年的研究表明，胍基丁胺还能抑制多种细胞(包括血管平滑肌细胞、星型胶质细胞、内皮细胞、肝癌细胞和肾小管上皮细胞等)的增殖。随着人们对胍基丁胺生理作用研究的深入，胍基丁胺显示了广阔的临床应用前景，特别是在神经系统中的应用前景尤其引入注意。在食品、化工、药物制备和临床等领域，国内外需求巨大，市场应用前景广阔。胍基丁胺的生产方法主要有化学法和生物酶法。化学法路线步骤多、收率低、成本高、不适合大规模的工业化生产。生物酶法主要是使用精氨酸脱羧酶(Argininedecarboxylase，EC 4.1.1.19)，这是一种5'
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磷酸吡哆醛(辅酶PLP)依赖型的脱羧酶。该酶可以L/>‑
精氨酸为底物，经脱羧基后生成胍基丁胺。酶法生产胍基丁胺工艺简单，周期短，耗能低，专一性强，收率高，提取方便。但是，在酶法生产胍基丁胺的过程中，如何获得低成本高效的酶源是关键问题。
[0003]虽然精氨酸脱羧酶的来源在植物、动物和微生物体内广为分布。但目前精氨酸脱羧酶主要还是通过化学合成法和微生物发酵法两种制备得到，其中化学合成法因其步骤繁复、造成的污染严重，产物收率较低等缺点日益被微生物发酵法所取代。微生物发酵法是通过诱变菌株或重组工程菌株，让微生物发酵产生精氨酸脱羧酶。所以如何构建精氨酸脱羧酶生产菌并能低成本高效的生产精氨酸脱羧酶是需要解决的问题。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种精氨酸脱羧酶生产菌的构建方法，包括以下步骤：
[0007](1)对Pg3启动子进行优化，将质粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将优化后的Pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pHT304上，得到质粒pHT304
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Pg3；
[0008](2)将步骤(1)得到的质粒pHT304
‑
Pg3用SphⅠ和SacⅠ双酶切处理，将SpeA基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304
‑
Pg3上，得到重组表达载体；
[0009](3)将步骤(2)得到的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌上，构建得到精氨酸脱羧酶生产菌。
[0010]优选的，步骤(1)中，优化后的Pg3启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]优选的，步骤(1)中，质粒pHT304
‑
Pg3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]优选的，步骤(2)中，所述SpeA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013]本专利技术的第二方面，提供上述构建方法构建的精氨酸脱羧酶生产菌。
[0014]本专利技术的第二方面，提供精氨酸脱羧酶生产菌在发酵生产精氨酸脱羧酶中的应用。
[0015]本专利技术的有益效果：
[0016](1)为提高精氨酸脱羧酶的产量、降低精氨酸脱羧酶的生产成本，本专利技术从基因工程菌株入手，构建得到了一种新的精氨酸脱羧酶生产菌。本专利技术的精氨酸脱羧酶生产菌通过外源转入SpeA基因提高了精氨酸脱羧酶的合成效果，SpeA基因的表达产物为精氨酸脱羧酶，能催化精氨酸生成胍基丁胺，并提高了合成的精氨酸脱羧酶的胞内、外的分泌能力。
[0017](2)虽然枯草芽孢杆菌是外源基因常用的表达宿主菌，但有些外源蛋白往往得不到有效的表达，其原因很可能是枯草芽孢杆菌本身的翻译系统不能满足外源基因表达的需要。为了使SpeA基因能够更适用于原核表达系统，本专利技术还对上述基因进行了密码子优化，采用优化后的编码基因进行原核表达，进一步提高了精氨酸脱羧酶的表达量。
附图说明
[0018]图1：(a)带酶切位点的质粒pHT304的结构图谱，(b)不带酶切位点的质粒pHT304的结构图谱，(c)质粒pHT304
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pg3的结构图谱，(d)质粒pHT304
‑
pg3
‑
speA的结构图谱。
[0019]图2：优化前SpeA基因的密码子相对适应度图。
[0020]图3：优化后SpeA基因的密码子相对适应度图。
[0021]图4：本专利技术实施例2构建的重组表达载体的酶切验证结果；图中，泳道从左至右：Marker，双酶切处理pht 304
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pg3
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speA，pht 304
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pg3，pht 304，speA
[0022]图5：本专利技术实施例3所得到的阳性转化子的Western bolt检测结果；图中，71kDa为凝血酶溶液切割前精氨酸脱羧酶的分子量，70.8kDa为凝血酶溶液切割后精氨酸脱羧酶的分子量。
具体实施方式
[0023]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0024]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
[0025]本专利技术实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
[0026]其中：本专利技术中实施例和对比例所使用的枯草芽孢杆菌购自中国微生物菌种查询网(https://www.biobw.org/China
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strain/bio
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81799.html)，菌种的编号为bio
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81799，
菌株名称为枯草芽胞杆菌168。
[0027]质粒pHT304为枯草芽孢杆菌表达载体，其结构图谱如图1所示。
[0028]需要说明的是，本专利技术精氨酸脱羧酶生产菌的构建方法，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对生产菌进行生物保藏。
[0029]实施例1：密码子优化
[0030]专利技术人从现有数据库中获得的SpeA基因的核苷酸序列如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精氨酸脱羧酶生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对Pg3启动子进行优化，将质粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将优化后的Pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pHT304上，得到质粒pHT304
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Pg3；(2)将步骤(1)得到的质粒pHT304
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Pg3用SphⅠ和SacⅠ双酶切处理，将SpeA基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304
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Pg3上，得到重组表达载体；(3)将步骤(2)得到的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌上，构建得到精氨酸脱羧酶生产菌。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳明瑞，谢沛，曹华杰，郭永胜，
申请(专利权)人：汕头市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：