用于提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒制造技术

本发明专利技术公开了用于提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒。所述选自pUS20D9M,pUS20XP1以及pUS20XP2中的任意一个；其中，质粒pUS20D9M序列如SEQ ID NO.1所示，质粒pUS20XP1序列如SEQ ID NO.2所示，质粒pUS20XP2序列如SEQ ID NO.3所示。枯草杆菌是一种重要的微生物。很多育种工作需要提高枯草杆菌的基因突变频率。然而，目前尚缺乏理想的控制枯草杆菌自发突变频率的方法。本发明专利技术借助CRISPRi技术和过表达易错型DNA聚合酶的方法，提高宿主的自发突变频率(最高达5128倍)。整个操作可通过质粒的转化和消除实现，无需对宿主进行基因敲除。进行基因敲除。进行基因敲除。

【技术实现步骤摘要】
用于提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒


[0001]本专利技术属于生物高
，公开了用于提高枯草芽孢杆菌自发突变率的质粒。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵工业、农业和环境保护等领域都发挥重要作用。比如枯草芽孢杆菌被用于重组蛋白表达、化合物生产、植物促生、生物防治和污染物降解等。在实际应用之前，通常要对菌株进行驯化和改造，即育种。物理或化学诱变是常用的育种方法，即通过物理或化学手段提高菌株的基因突变频率，然后筛选目标突变株。该方法的缺点是突变效率低和突变谱窄，且存在危险和污染问题。因此，科研人员尝试提高菌株的自发突变频率。具体策略包括敲除菌株的错配修复系统和表达易错型DNA聚合酶等等。然而，理想的方法应该是不改变宿主的基因型，实现可拔插式操作。迄今，枯草芽孢杆菌中尚无这种理想型的突变方法。鉴于此，本专利技术提供可以提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒，导入质粒即可提高宿主的基因突变频率，丢失质粒后宿主的基因突变频率则恢复正常。该质粒可以应用于枯草芽孢杆菌的育种。
专利技术内容
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒，其特征在于，选自pUS20D9M,pUS20XP1以及pUS20XP2中的任意一个；其中，质粒pUS20D9M序列如SEQ ID NO.1所示，质粒pUS20XP1序列如SEQ ID NO.2所示，质粒pUS20XP2序列如SEQ ID NO.3所示。2.权利要求1所述的质粒在提高枯草芽孢杆菌自发突变频率中的应用。3.一种提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的方法，其特征在于将权利要求1中所述的任意一种质粒转染枯草芽孢杆菌在含有1％木糖的LB培养基中36℃
‑
38℃培养10
‑
14h,优选培养12h。4.质粒pUS20D9M的构建方法，其特征在于通过同源重组的方式将含有木糖诱导的dCas9表达盒以及干扰mutSL的sgRNA表达盒构建在质粒pUS20上；其中，所述的含有木糖诱导的dCas9表达盒序列如SEQ ID NO.1中第4175bp
‑
8281bp所示；所述的干扰mutSL的sgRNA表达盒序列如SEQ ID NO.1中第第8310bp
‑
8480bp所示。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于以质粒pJMP1为模板，用引物P1/P2扩增含有木糖诱导的dCas9表达盒xylR
‑
P
xyl
‑
dcas9部分；合成干扰mutSL的sgRNA表达盒序列，然后经引物P3/P4扩增后得到片段P
veg
‑
sgmutSL；以质粒pUS20为模板，用引物P5/P6扩增质粒pUS20全部序列；然后，将上述3片段通过同源重组的片段融合成环状质粒；最终，将上述融合产物转化到大肠杆菌DH5α后，经100ppm氨苄青霉素筛选后得到质粒pUS20D9M；其中各引物序列如下所示：6.质粒pUS20XP1的构建方法，其特征在于，通过同源重组的方式将木糖诱导失去校对功能的DNA聚合酶PolC
*
表达盒以及干扰polC的sgRNA表达盒构建在质粒pUS20上，生成质粒pUS20XP1；所述的木糖诱导失去校对功能的DNA聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫新，叶斌，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：