一株同步生产木糖醇和乙醇的工业酿酒酵母菌株及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一株同步生产木糖醇和乙醇的工业酿酒酵母菌株及其构建方法，该菌株高表达FPS1基因和XYL1基因。具体地，该菌株为SEB20，其分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.22590，以酿酒酵母SEB10为出发菌株，将基因FPS1的启动子P

【技术实现步骤摘要】
一株同步生产木糖醇和乙醇的工业酿酒酵母菌株及其构建方法


[0001]本专利技术涉及微生物基因工程
，具体涉及一株同步生产木糖醇和乙醇 的工业酿酒酵母菌株及其构建方法。

技术介绍

[0002]化石燃料的大量消耗已经引起了能源枯竭、价格上涨和全球气候变化等严重 的问题。木质纤维素生物质如农业废弃物(甘蔗渣、玉米芯、玉米秸秆、小麦和 稻秆等)、废木料、工业废弃物(包括纸浆、纸张加工废物等)可作为生物燃料 的潜在原料，因其来源广泛，成本低廉，经过对环境无害的生物处理来生产燃料 乙醇，有利于农村社区和整个社会的宏观经济效益。在中国每年约有9亿多吨秸 秆产生，秸秆综合利用率超85％，2020年后秸秆综合利用率还需要进一步提升。 在此背景下，基于碳中和的生命周期分析，木质纤维素生物质是燃料乙醇生产的 有利原料。燃料乙醇的使用可以改善城市空气质量，减少温室气体、氮氧化物和 碳氢化合物的排放，减轻环境压力。
[0003]木质纤维素生物质原料主要由纤维素、半纤维素和木质素三部分组成，其水 解液中主要六碳糖为葡萄糖，主要五碳糖为木糖。然而，利用木糖、阿拉伯糖等 戊糖发酵成乙醇，代谢效率较低，因此，基于生物炼制的概念，利用这些戊糖生 产高值化学品，如木糖醇，更经济可行。木糖醇是一种天然的五碳糖醇，可作为 糖尿病患者的糖替代品等。生物法生产木糖醇条件温和、工艺简单可行，操作性 可控性强，污染少，分离成本低，具有良好的应用前景，是实现废物资源化、无 害化，替代化学加氢法生产的有效途径。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 是经由GRAS(Generally Recognized As Safe)认证的安全菌株。而工业酿酒酵 母具有耐热性能好、耐受抑制物性能佳等优点，用其作为基因工程改造的出发菌 株，将木糖还原酶基因XYL1导入酿酒酵母可使木糖还原为木糖醇，并可获得高 产木糖醇的工程菌。但是在葡萄糖和木糖共发酵的情况下，由于存在葡萄糖效应， 胞内木糖的高速代谢仍处于瓶颈，因而提高木糖的代谢通量至关重要。
[0004]结合前期研究，本专利技术旨在人为改造工业酿酒酵母，在突变了转运子HXT3 之后获得的菌株SEB10(申请号：CN201810092198.9)的基础上，为了进一步 提升木糖代谢通量，通过高表达水甘油通道蛋白基因FPS1和提高XYL1基因拷 贝数，提高酿酒酵母利用实际物料如秸秆共发酵木糖和葡萄糖的能力，从而提高 其木糖醇和乙醇的同步生产性能。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决现有来源于热带假丝酵母CtXYL1(编码木糖还原酶) 基因在酿酒酵母中异源表达后，为了模拟其在木质纤维素水解液中的发酵过程， 选取初始浓度高的葡萄糖作为碳源供给时，其构建的重组菌木糖代谢速率慢、木 糖醇产量低、不能满足发酵需求的问题，进而提供解决上述问题的一株高表达 FPS1基因，且将SOR1/SOR2基因编码区替换为CtXYL1基因使其在共发酵葡萄 糖和木糖条件下高产木糖醇及乙醇的工业酿酒
酵母菌株SEB20及其构建方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面是提供一株同步生产木糖醇和乙醇的工业酿酒酵母菌株， 该菌株高表达FPS1基因和XYL1基因。
[0008]进一步地，上述酿酒酵母菌株为SEB20，其分类命名为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.22590。
[0009]本专利技术的第二方面是提供上述工业酿酒酵母菌株的构建方法，以酿酒酵母 SEB10为出发菌株，将基因FPS1的启动子P
FPSl
替换为强启动子P
TDH3
，且在SOR1 和SOR2两个位点基因编码区敲除的同时增加CtXYL1基因的拷贝数。
[0010]进一步地，上述构建方法包括如下步骤：
[0011]步骤一，将核酸序列为SEQ ID NO.1的质粒Cas9
‑
NAT通过醋酸锂转化法转 化到酿酒酵母SEB10菌株中，通过PCR扩增筛选获得阳性转化子SEB10
‑
Cas9；
[0012]步骤二，设计识别FPS1基因上游的gRNA片段：
[0013]GCAATTCAGTAGTTAAAAGC，以及重组修复DNA片段并合成双链 P
FPS1
‑
P
TDH3
：以SEB10基因组为DNA为模板，采用序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物进行PCR扩增；
[0014]步骤三，构建识别FPS1基因上游的gRNA质粒：以pMEL13质粒为模板， 利用5
’
端经过磷酸化的引物扩增含gRNA的线性质粒，回收线性质粒骨架，转 化筛选得到质粒pMEL13
‑
UpFPS1
‑
gRNA
‑
3；该5
’
端经过磷酸化的引物的序列为 SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9；
[0015]步骤三，将上述质粒pMEL13
‑
UpFPS1
‑
gRNA
‑
3以及重组修复片段P
FPS1
‑
P
TDH3
通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母SEB10
‑
Cas9菌株中，筛选获得FPS1突变菌 株；
[0016]步骤四，脱除Cas9
‑
NAT质粒以及pMEL13
‑
M
‑
HXT3
‑
gRNA质粒获得不含 Cas9
‑
NAT质粒以及gRNA质粒的菌株；然后进行试管发酵，根据发酵结果筛选 出一株高木糖消耗菌株SEB10
‑
FTD13；
[0017]步骤五，将Cas9
‑
NAT质粒导入酿酒酵母SEB10
‑
FTD13得到菌株 SEB10
‑
FTD13
‑
Cas9：
[0018]步骤六，设计识别SOR1/SOR2基因编码区的gRNA片段： AGAGTGTACACCGACTGATA，以及重组修复DNA片段的扩增：以SEB10基 因组DNA为模板，采用序列为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15的引物进行扩增；
[0019]步骤七，构建识别SOR1/SOR2基因上游的gRNA质粒：以pMEL13质粒为 模板，利用5
’
端经过磷酸化的引物扩增含gRNA的线性质粒，回收线性质粒骨 架，转化筛选得到质粒pMEL13
‑
SOR
‑
gRNA；该5
’
端经过磷酸化的引物的序列 为SEQ ID NO.14和SEQ D NO.15；
[0020]步骤八，将步骤六扩增的重组修复DNA片段和质粒pMEL13
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO.12。8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述2％YPD平板包括10g/L酵母浸出粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、15g/L琼脂、100μg/mL G418和80μg/mL诺尔斯菌素。9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤四和步骤九的具体过程如下：针对上步骤的阳性转化子，在营养丰富的YPD培养基中过夜培养，涂布于YPD平板上；之后挑取单菌落分别于YPD平板、YPD...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤岳琴，陈栋，杨白雪，谢采芸，
申请(专利权)人：中石化上海工程有限公司中石化炼化工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：