高产生成香兰素的培养组合物及其使用方法技术

本发明专利技术提供了用于在对氨基苯甲酸(PABA，4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高产生成香兰素的培养组合物及其使用方法
[0001]本申请要求并享有于2020年9月15日提交的美国临时申请号63/078,841的优先权及权益，其内容通过引用其全文并入本专利技术。
专利

[0002]本专利技术涉及发酵组合物，以及使用所述发酵组合物生成香兰素和/或葡糖香兰素以及可由其中之一或两者合成或生物合成的任何化合物的方法。专利技术背景
[0003]香兰素是世界上用量最大的香料成分。仅有约1％的香草风味成分供应来自香草兰花的香草提取物。“天然”香兰素需求旺盛，但供应不足，且价格高昂。可替代的、低成本、大批量的“天然”香兰素来源将是调味品市场一个有利可图的补充。通过酵母对糖进行发酵从头生成的香兰素，与目前市场上的替代品相比，具有以更低的成本生成“天然”香兰素的潜力。
[0004]有几种方法可用于通过天然前体(包括除葡萄糖以外的前体)的生物转化来生成“天然”香兰素。一种途径是在某些植物的某些部分大量存在的阿魏酸的生物转化。已鉴定出微生物，其可通过生成香兰素作为中间体的途径分解代谢阿魏酸。可对这些微生物进行工程改造，以减少香兰素进一步分解代谢为不需要的副产物，从而优化香兰素的生成。Gallage et al.,Molecular Plant,8:40
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57(2015)。在类似的方法中，更具成本效益的底物丁香酚可被微生物分解代谢为阿魏酸，并进一步分解代谢为香兰素(Gallage等人)。
[0005]未见已知的微生物可天然地将葡萄糖转化为香兰素(Gallage等人)。1998年，开发了一种从葡萄糖到香兰素的酶促路线，所述路线通过3个附加酶促步骤将天然产生的代谢物3
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脱氢莽草酸(3
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dehydroshikimate)转化为香兰素：1)脱水以生成原儿茶酸(3,4
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二羟基苯甲酸)，2)3
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羟基基团的O
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甲基化，和3)使羧酸还原成醛。Li and Frost,J.Am.Chem.Soc.,120:10545
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10546(1998)。通过表达催化3
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DHS脱水酶(AroZ)和儿茶酚
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O
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甲基转移酶(COMT)的异源酶，在大肠杆菌(E.coli)中生成香草酸(步骤1和步骤2)证明了这一过程。采用由真菌纯化的芳香族羧酸还原酶(ACAR)进行的酶促转化用于在体外将香草酸转化为香兰素。
[0006]Hansen等人证明了通过表达上述酶与异源PPTase的组合，在单一重组生物体酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中由葡萄糖从头生物合成香兰素，所述异源PPTase被鉴定为激活此生物体中的ACAR酶所必需的。Hansen et al.,Appl.Environ.Microbiol.75:2765
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2774(2009)。此外，它们表达UDP
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葡萄糖基转移酶，将有毒的香兰素产品转化为毒性低得多的葡糖香兰素。
[0007]已报道许多其他修饰来提高酵母中香兰素生物合成的效率。为了提高葡糖香兰素的效价，Hansen等人证明，重要的是通过删除天然还原酶(即，ADH6)来减少内源性还原酶活性，以减少香兰素向香草醇的转化，并通过删除EXG1来消除天然β
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葡萄糖苷酶活性，以减少发酵过程中葡萄糖部分的水解。在随后的申请文件中，据报道使用香草醇氧化酶可进一步减少香兰素还原成香草醇过程中的碳损失。US 2014/0245496A1；WO 2015/121379 A2。为了
减少碳对不需要的异构体异香兰素(通过4
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OH而非3
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OH的甲基化生成)的损失，人变体Hs.COMT被用作酶进化的起点。获得对正确香兰素异构体具有高度特异性的突变体。为了增加通向原儿茶酸(PCA)的通量并减少通向莽草酸途径代谢物的通量，生成了Aro1(称为AROM)的突变体形式，所述突变体形式在E结构域中具有突变，使用3
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DHS作为底物可降低莽草酸反应的活性。
[0008]因此，进一步的遗传修饰可提供低成本、高产量的“天然”香兰素来源，这将是调味品市场的重要补充。
专利技术摘要
[0009]本专利技术提供了用于改进香兰素和/或葡糖香兰素生成的组合物及方法。所述这些组合物和方法部分基于对营养物即对氨基苯甲酸的发现，所述营养物对氨基苯甲酸能够促进某些细胞株生成香兰素和/或葡糖香兰素。虽然无意受任何特定操作理论的约束，但本专利技术的实施例表明，增加培养物中对氨基苯甲酸的量可提高香兰素或葡糖香兰素生成的产量及生产率。
[0010]一方面，本专利技术提供了发酵组合物，其包含能够生成香兰素或葡糖香兰素的一种或多种酵母菌株以及与常规酵母发酵组合物相比增加量的对氨基苯甲酸。本专利技术描述了对氨基苯甲酸的有用量。在特定实施方案，所述发酵组合物进一步包含适于所述酵母菌株生长和适于香兰素或葡糖香兰素生成的营养物类、矿物质类、维生素类及碳源类。
[0011]另一方面，本专利技术提供了生成香兰素或葡糖香兰素的方法，其包括：在适于制备香兰素或葡糖香兰素的条件下，在具有增加量的对氨基苯甲酸的培养基中培养本专利技术所述的细胞株群体，以生成培养液(culture broth)；和从所述培养液回收所述香兰素或葡糖香兰素。
[0012]另一方面，本专利技术提供了通过本专利技术提供的方法生成的香兰素或葡糖香兰素。
[0013]所述组合物和方法可用于生成用于任何目的的香兰素和/或葡糖香兰素，包括用作调味剂及食品成分。其亦可用于生成可由香兰素和/或葡糖香兰素合成或生物合成的任何化合物。所述化合物可合成产生，或利用下游酶或途径生物合成产生，或其组合。此类化合物包括香草酸、香草醇、阿魏酸、丁香酚和胡椒醛。附图简要说明
[0014]图1是示出从葡萄糖到香兰素和葡糖香兰素的酶促途径的示意图。
[0015]图2是96孔板实验提供的g/L香兰素相对效价图，所述实验在培养物中使用香兰素生成菌株，比较含有标准pABA的培养基和含有1/50标准量pABA的培养基。菌株在n＝4时运行，通过将pABA标准浓度的最高数据点设置为值1从而对所述值进行归一化，所有其他数据点均是相对于此数据点归一化的相对倍数增加数或减少数。误差条表示与平均值的1个标准差。
[0016]图3是提供在具有4.8mg/L或24mg/L对氨基苯甲酸的培养物中使用香兰素生成菌株发酵7天的相对累积产量(重量％；香兰素+香草醇)和相对累积生产率(g/L/h；香兰素+香草醇)的图表。累积表示从时间0到指定时间的间隔值。菌株在n＝2时运行，所述值均取平均值，误差条表示与平均值的1个标准偏差。
具体实施方式
术语
[0017]本专利技术使用的术语“约”或“大约”是指由本领域技术人员确定的大约值的合理范围。在某些实施方案，术语约或大约是指
±
一个、两个或三个标准偏差。在某些实施方案，术语约或大约是指本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.发酵组合物，其包含：(a)能够生成香兰素(vanillin)或葡糖香兰素(glucovanillin)的一种或多种经遗传修饰的酵母菌株，所述一种或多种经遗传修饰的酵母菌株包含一种或多种异源基因和/或一种或多种基因过表达；和(b)至少约1mg/L对氨基苯甲酸。2.根据权利要求1所述的发酵组合物，其包含约1mg/L至约50mg/L的对氨基苯甲酸。3.根据权利要求1所述的发酵组合物，其包含约1mg/L至约50mg/L、约1mg/L至约45mg/L、约1mg/L至约40mg/L、约1mg/L至约35mg/L、约1mg/L至约30mg/L、约1mg/L至约25mg/L、约2mg/L至约30mg/L、约3mg/L至约30mg/L、约4mg/L至约30mg/L、或约5mg/L至约30mg/L的对氨基苯甲酸。4.根据权利要求1
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3任一项所述的发酵组合物，其进一步包含由所述一种或多种酵母菌株生成的香兰素。5.根据权利要求1
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3任一项所述的发酵组合物，其进一步包含由所述一种或多种酵母菌株生成的葡糖香兰素。6.根据前述权利要求任一项所述的发酵组合物，其进一步包含约1％的酵母提取物、约2％的蛋白胨、和约2％的葡萄糖。7.根据权利要求1
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6任一项所述的发酵组合物，其进一步包含磷酸钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、氯化镁、氯化钴、钼酸钠、硫酸铁、氯化钙、生物素、烟酸、肌醇、吡哆醇(pyridozine)、硫胺素、泛酸钙、和/或乙二胺四乙酸(EDTA)，其各自的量适于所述一种或多种经遗传修饰的酵母菌株的生长以及适于所述香兰素或葡糖香兰素的生成。8.根据权利要求1
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7任一项所述的发酵组合物，其中所述一种或多种异源基因和/或一种或多种基因过表达包含AroB、AroD、AroF、和AroZ。9.根据权利要求1
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8任一项所述的发酵组合物，其中所述一种或多种异源基因和/或一种或多种基因过表达包含OMT。10.根据权利要求1
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9任一项所述的发酵组合物，其中所述一种或多种异源基因和/或一种或多种基因过表达包含PPTASE和ACAR。11.根据权利要求1
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10任一项所述的发酵组合物，其中所述一种或多种异源基因和/或一种或多种基因过表达包含EAO。12.根据权利要求1
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11任一项所述的发酵组合物，其中所述一种或多种异源基因和/或一种或多种基因过表达包含UDP
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糖基转移酶(UGT)。13.根据权利要求1
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7任一项所述的发酵组合物，其中所述一种或多种异源基因和/或一种或多种基因过表达包含AroB、AroD、AroF、AroZ、OMT、PPTase、ACAR、EAO、和UGT。14.根据权利要求13所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：发明
国别省市：