用于高效生成瑞鲍迪苷的甜叶菊异贝壳杉烯酸羟化酶变体制造技术

本发明专利技术提供了用于在宿主细胞中改进生成甜菊糖苷类化合物的组合物和方法。在一些实施方案，对所述宿主细胞进行遗传修饰以包含编码甜叶菊(Stevia rebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述宿主细胞还包含一种或多种异源核苷酸序列，所述一种或多种异源核苷酸序列编码能够在所述宿主细胞中生成一种或多种甜菊糖苷的途径的其他酶。本发明专利技术所述的组合物和方法提供了异源生成甜菊糖苷类化合物(包括但不限于瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的有效途径。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于高效生成瑞鲍迪苷的甜叶菊异贝壳杉烯酸羟化酶变体1.专利
本专利技术涉及某些异贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)，包含所述异贝壳杉烯酸羟化酶的组合物，包含所述异贝壳杉烯酸羟化酶的宿主细胞，以及其用于生成甜菊醇(steviol)和/或瑞鲍迪苷(包括瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的方法。2.专利技术背景需要源自天然来源的零热量甜味剂来限制高糖消耗(例如，糖尿病类和肥胖症)的不良影响。瑞鲍迪苷M(RebM)是由甜叶菊植物(S.rebaudianaBertoni)生成的许多甜味化合物之一。在所有的瑞鲍迪苷中，RebM具有最高的效力(比蔗糖甜约200-300倍)，口感最纯净。然而，RebM仅由甜叶菊植物少量生成，并且仅占甜菊糖苷(steviolglycoside)总含量的一小部分(<1.0％)，Ohtaetal.,2010,J.Appl.Glycosci.,57,199-209(2010)。因此，希望使用生物技术途径来生成RebM，从而使其能够大量且高纯度地生成。为了使用生物技术经济地生成产品，从原料到产品的生物转化中的每个步骤需具有高转化效率(理想地>90％)。在我们生成RebM的酵母工程中，我们在RebM的途径早期便发现了生物合成步骤的局限性，所述途径可将异贝壳杉烯酸(kaurenoicacid)转化为甜菊醇(图1)。在植物甜叶菊(Steviarebaudiana)中发现了异贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)，其通常用于由植物激素前体异贝壳杉烯酸生成C20类异戊二烯类甜菊醇。即使甜叶菊(S.rebaudiana)可积累多达叶干重的约15％的甜菊糖苷类化合物，但通过KAH酶的通量可能并非商业生产酵母中大批量RebM生成所必需的。常规而言，来自甜叶菊(Steviarebaudiana)的野生型KAH酶(Sr.KAH)已被用于在经工程改造以生成RebM的酵母中将异贝壳杉烯酸转化为甜菊醇。为了高效且高纯度地生成RebM，需要能够高效生成甜菊醇的改进酶。本专利技术提供的组合物和方法满足了此种需求，并且还提供了相关优点。3.专利技术摘要本专利技术提供了改进的将异贝壳杉烯酸转化为甜菊醇的组合物和方法。所述这些组合物和方法部分基于能够以非常高的效率将异贝壳杉烯酸转化为甜菊醇的某些异贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)的生成。假设市场对RebM的需求为每年50亿吨，即使使用新的KAH进行菌株性能方面的适度改进(例如，改进了10％)，则也可能在未来节省超过一千万美元的生产成本。本专利技术所述的某些KAH还能够生成含有很少或不含残留异贝壳杉烯酸的甜菊醇。因此，在某些实施方案，本专利技术所述的组合物和方法可降低下游加工成本以得到具有高产量甜菊糖苷类化合物(例如RebM)的组合物。一方面，本专利技术提供了经遗传修饰的宿主细胞及其用于生成工业上有用的化合物的方法。一方面，本专利技术提供了经遗传修饰的宿主细胞，其包含：编码本专利技术提供的甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的异源核酸。在一些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞进一步包含能够生成甜菊醇和/或甜菊糖苷类化合物的一种或多种酶促途径。在某些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞能够以大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、或98％的效率将异贝壳杉烯酸转化为甜菊醇。另一方面，本专利技术提供了生成异源甜菊糖苷的方法，所述方法包含：在适于制备所述异源甜菊糖苷化合物的条件下，在含有碳源的培养基中培养本专利技术提供的经遗传修饰的宿主细胞群，所述经遗传修饰的宿主细胞群能够生成本专利技术所述的异源甜菊糖苷；和从所述培养基回收所述甜菊糖苷。在一些实施方案，所述异源甜菊糖苷选自由RebD和RebM组成的组。另一方面，本专利技术提供了生成RebD的方法，所述方法包含：在适于制备所述RebD的条件下，在含有碳源的培养基中培养本专利技术提供的能够生成本专利技术所述RebD的经遗传修饰的宿主细胞群；和从所述培养基回收所述RebD。另一方面，本专利技术提供了生成RebM的方法，所述方法包含：在适于制备所述RebM的条件下，在含有碳源的培养基中培养本专利技术提供的能够生成本专利技术所述RebM的经遗传修饰的宿主细胞群；和从所述培养基回收所述RebM。另一方面，本专利技术提供了生成甜菊醇的方法，所述方法包含：在适于形成甜菊醇的条件下，使异贝壳杉烯酸与本专利技术所述的异贝壳杉烯酸羟化酶接触，所述异贝壳杉烯酸羟化酶能够将异贝壳杉烯酸转化为甜菊醇。在一些实施方案，所述宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方案，所述酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一些实施方案，所述宿主细胞以高效率生成RebD或RebM。在一些实施方案，与不含本专利技术提供的甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶多肽的酵母细胞相比，所述宿主细胞生成增加量的RebD或RebM。4.附图简要说明图1提供了由原生酵母代谢产物法呢基焦磷酸(FPP)到瑞鲍迪苷M(RebM)的酶促途径。图中描绘了香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)、柯巴基焦磷酸(CPP)和几种瑞鲍迪苷(Reb)。图2提供了“着陆垫(landingpad)”设计的示意图，所述着陆垫设计用于插入单独的KAH酶以筛选酵母中异贝壳杉烯酸到甜菊醇的转化。图3提供了Sr.KAH突变体，每个突变体包含单个氨基酸变化，所述突变体具有比野生型Sr.KAH等位基因高至少一个标准偏差的活性。Y轴代表由Sr.KAH变体生成的19-糖苷(菌株1)或RebM(菌株2)与野生型Sr.KAH生成的19-糖苷或RebM的比值。图4提供了导致酵母菌株中体内活性从4.3倍提高到6.3倍的Sr.KAH蛋白突变的组合；在菌株3背景中测定Sr.KAH活性。Y轴是突变型Sr.KAH等位基因相对于野生型Sr.KAH的相对倍数增加；野生型Sr.KAH活性归一化为1。图5提供了改进的KAH突变体，其与野生型Sr.KAH相比，可导致底物异贝壳杉烯酸减少，这表明具有提高活性的Sr.KAH等位基因可将更多的底物转化为甜菊醇。图6提供了在第一层(Tier1)筛选中测得的简并密码子库突变体相对于Sr.KAH突变体#3等位基因的体内KAH活性，如实施例7所述，使用总甜菊糖苷类化合物的滴度(μM)。5.具体实施方式5.1术语定义本专利技术使用的术语“异源的/异源性/异源”是指通常在自然界中不存在的物质。术语“异源核苷酸序列”是指自然界中在给定细胞中通常不存在的核苷酸序列。因此，异源核苷酸序列可以是：(a)相对于其宿主细胞是外源的(即，对所述细胞而言是“外源的”)；(b)天然存在于所述宿主细胞中(即“内源性/內源的/內源”)，但在所述细胞中以非天然量存在(即，比所述宿主细胞中天然存在的量更多或更少)；或(c)天然存在于所述宿主细胞中，但位于其天然基因座之外。另一方面，本专利技术使用的术语“原生的/天然的”或“内源的/内源性/內源”涉及分子，特别是酶和核酸，表示在它们起源或在自然界中发现的生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有根据SEQ ID NO：1的残基编号的异贝壳杉烯酸(kaurenoic acid)羟化酶多肽，其包含下列突变中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11个：I166R、I153L、S158D、G306L、L232D、I333V、I350L、V316L、G447V、和M308L。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181015 US 62/7459001.具有根据SEQIDNO：1的残基编号的异贝壳杉烯酸(kaurenoicacid)羟化酶多肽，其包含下列突变中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11个：I166R、I153L、S158D、G306L、L232D、I333V、I350L、V316L、G447V、和M308L。


2.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：I166R和I333V。


3.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：I166R、1350L、和G447V。


4.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：I153L、S158D、I166R、L232D、I333V、和I350L。


5.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：S158D、G306L、和1350L。


6.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：G306L、V316L、1350L、和G447V。


7.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：G306L、V316L、I333V、和I350L。


8.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：S158D、I166R、L232D、G306L、和I333V。


9.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：L232D、G306L、V316L、I333V、和1350L。


10.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：I166R、L232D、G306L、和1350L。


11.根据权利要求1所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变：S158D、I166R、G306L、M308L、V316L、和1350L。


12.根据前述权利要求任一项所述的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其进一步包含异源氨基端结构域。


13.具有根据SEQIDNO：1的残基编号的异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含下列突变中的至少一个：Y62H、T164R、L76V、Q415L、A60Y、S182C、T167N、Y52H、R266D、T167H、I153L、K100L、G306C、Q120N、L232H、I333V、G351R、L232S、I166S、W447C、I443Y、I166N、N355Y、L232D、S158D、A442G、G306N、V316L、M308L、G447F、G306I、G306V、I350L、G447V、I166R、和G306L。


14.嵌合异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含：
(i)甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的催化结构域，和
(ii)内质网(ER)结合蛋白的N端跨膜结构域，其中所述N端跨膜结构域共价连接至所述催化结构域。


15.根据权利要求14所述的嵌合异贝壳杉烯酸水解酶多肽，其进一步包含下列异贝壳杉烯酸水解酶突变中的至少一个：I166R、I153L、S158D、G306L、L232D、I333V、I350L、V316L、G447V、和M308L，其中所述残基编号均根据SEQIDNO：1。


16.根据权利要求14或15所述的嵌合异贝壳杉烯酸水解酶多肽，其进一步包含选自下列的所述异贝壳杉烯酸水解酶突变中的至少一个：Y62H、T164R、L76V、Q415L、A60Y、S182C、T167N、Y52H、R266D、T167H、I153L、K100L、G306C、Q120N、L232H、I333V、G351R、L232S、I166S、W447C、I443Y、I166N、N355Y、L232D、S158D、A442G、G306N、V316L、M308L、G447F、G306I、G306V、I350L、G447V、I166R、和G306L，其中所述残基编号均根据SEQIDNO：1。


17.根据权利要求14-16任一项所述的嵌合异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含：
(i)甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的催化结构域，和
(ii)ATR2的N端跨膜结构域，其中所述N端跨膜结构域共价连接至所述催化结构域。


18.根据权利要求17所述的嵌合异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含：
(i)甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的催化结构域，其中所述催化结构域包含所述甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的第23至500位氨基酸，和
(ii)ATR2的N端跨膜结构域，其中所述N端结构域包含ATR2的第1至72位氨基酸，和其中所述N端跨膜结构域共价连接至所述催化结构域。


19.根据权利要求17所述的嵌合异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其中，所述催化结构域包含所述甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的第5至500位氨基酸。


20.根据权利要求17所述的嵌合异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其中，所述催化结构域包含所述甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的第23至500位氨基酸。


21.根据权利要求17所述的嵌合异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其中，所述催化结构域包含所述甜叶菊(Steviarebaudiana)异贝壳杉烯酸羟化酶的第47至500位氨基酸。


22.根据权利要求17所述的嵌合异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其中，所述N端结构域包含所述拟南芥(Arabidopsisthaliana)ATR2蛋白的第1至72位氨基酸。


23.根据权利要求17所述的嵌合异贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其中，所述N端结构域包含所述拟南芥(Arabidopsisthal...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·A·威克曼，李文宗，S·隆德，S·J·杰克逊，C·V·加尔西亚德冈萨洛，H·瓦宾顿，熊一，S·A·鲍里索娃，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US