用于高效生成瑞鲍迪苷的ABC转运蛋白制造技术

本发明专利技术提供了用于改进甜菊糖苷生成量的经遗传修饰的宿主细胞、组合物和方法。在一些实施方案，所述宿主细胞经遗传修饰以包含异源核酸表达盒，所述异源核酸表达盒表达能够将甜菊糖苷转运至细胞外空间或转运至细胞内细胞器的腔空间的ABC转运蛋白。在一些实施方案，所述宿主细胞进一步包含一种或多种异源核苷酸序列，所述一种或多种异源核苷酸序列编码能够在所述宿主细胞中生成一种或多种甜菊糖苷的途径的其他酶。本发明专利技术所述的宿主细胞、组合物和方法提供了异源生成甜菊糖苷(包括但不限于，瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的有效途径。瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的有效途径。瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的有效途径。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于高效生成瑞鲍迪苷的ABC转运蛋白
1.相关申请的交叉引用本申请要求并享有于2019年1月24日提交的、专利技术名称为“ABC TRANSPORTERS FOR THE HIGH EFFICIENCY PRODUCTION OF REBAUDIOSIDES”的美国临时专利申请序列号62/796,228的优先权，此临时申请的内容在此通过引用完全并入本申请。
2.专利

本专利技术涉及特定的ABC转运蛋白(ABC
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transporter)、包含所述ABC转运蛋白的宿主细胞，以及其用于生成甜菊醇和/或瑞鲍迪苷(包括瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的方法。3.专利技术背景
[0001]需要源自天然来源的低热量甜味剂来限制高糖消耗对健康的影响。甜叶菊植物(Stevia rebaudiana Bertoni)产生多种甜味的糖基化二萜，称为甜菊糖苷(steviol glycoside)。在所有已知的甜菊糖苷中，Reb M的效力最高(比蔗糖甜约200
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300倍)，并具有最吸引人的风味特征。然而，Reb M仅由甜叶菊植物少量生成，并且仅占甜菊糖苷总含量的一小部分(<1.0％)，因此从甜菊叶中分离Reb M是不切实际的。需要其他获得Reb M的方法。其中一种方法是应用合成生物学来设计微生物(例如，酵母)，其可从可持续原料来源生成大量Reb M。
[0002]为了使用合成生物技术经济地生成产品，从原料到产品的生物转化中的每个步骤均需具有高转化效率(理想情况下>90％)。在我们对酵母进行工程改造以生成RebM时，我们注意到Reb M的细胞溶质积聚抑制了工程化到酵母中的甜菊糖苷代谢途径，从而限制了发酵运行的总产量。此种抑制可能是由于参与甜菊糖苷生物合成的一种或多种酶的产物抑制或终产物抑制所致。因此，需要减轻产物抑制的新机制，以提高生物合成Reb M生成量的转化效率。
4.专利技术摘要
[0003]本专利技术提供了用于改进Reb M的生成量的经遗传修饰的宿主细胞、组合物和方法。所述这些组合物和方法部分基于某些异源ABC转运蛋白在宿主细胞中的表达，所述宿主细胞经遗传修饰以生成甜菊糖苷类化合物，例如Reb M。所述这些ABC转运蛋白能够将某些甜菊糖苷，优选Reb M和/或相关的高分子量甜菊糖苷瑞鲍迪苷D(Reb D)，从胞质溶胶转运至细胞外空间或转运至亚细胞器的腔内，例如酵母液泡。某些甜菊糖苷(如Reb D和Reb M)的螯合可通过减轻由甜菊糖苷积聚引起的产物抑制来提高甜菊糖苷代谢途径的效率。
[0004]在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了经遗传修饰的宿主细胞及其用于生成工业上有用的化合物的方法。一方面，本专利技术提供了能够生成一种或多种甜菊糖苷(steviol glycoside)的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码ABC转运蛋白的异源核酸，所述ABC转运蛋白具有与选自由下列组成的组的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、和SEQ ID NO：30。
NO：5的所述序列。
[0013]在实施方案中，所述ABC转运蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：6的所述序列。
[0014]在另一实施方案，所述ABC转运蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：7的所述序列。
[0015]又在另一实施方案，所述ABC转运蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：8的所述序列。
[0016]又在另一实施方案，所述ABC转运蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：28的所述序列。
[0017]又在另一实施方案，所述ABC转运蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：29的所述序列。
[0018]又在另一实施方案，所述ABC转运蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：30的所述序列。
[0019]在本专利技术的实施方案中，所述一种或多种甜菊糖苷选自瑞鲍迪苷A(Reb A)、瑞鲍迪苷B(Reb B)、Reb D、瑞鲍迪苷E(Reb E)、或Reb M。在另一实施方案，所述一种或多种甜菊糖苷包含Reb M。
[0020]在一个实施方案，大部分所述一种或多种甜菊糖苷积聚在细胞器的腔内。在另一实施方案，大部分所述一种或多种甜菊糖苷积聚在细胞外。
[0021]另一方面，本专利技术提供了表达ABC转运蛋白的异源核酸表达盒的核酸序列。在实施方案中，所述异源核酸表达盒的所述核苷酸序列具有SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、或SEQ ID NO：27的编码序列，其中所述编码序列可操作地连接至异源启动子。
[0022]另一方面，本专利技术提供了生成甜菊醇或一种或多种甜菊糖苷的方法，其包含：在适于制备甜菊醇或一种或多种甜菊糖苷的条件下，在含有碳源的培养基中培养本专利技术所述的宿主细胞的种群以生成培养液(culture broth)；和从所述培养液回收所述甜菊醇或一种或多种甜菊糖苷。
[0023]另一方面，本专利技术提供了生成Reb D的方法，其包含：在适于制备Reb D的条件下，在含有碳源的培养基中培养本专利技术所述的宿主细胞的种群以生成培养液；和从所述培养液回收所述Reb D化合物。
[0024]另一方面，本专利技术提供了生成Reb M的方法，其包含：在适于制备Reb M的条件下，在含有碳源的培养基中培养本专利技术所述的宿主细胞的种群以生成培养液；和从所述培养液回收所述Reb M化合物。5.附图简要说明
[0025]图1是示出从天然酵母代谢物法呢基焦磷酸(FPP)到甜菊醇的酶促途径的示意图。
[0026]图2是示出从甜菊醇到瑞鲍迪苷M的酶促途径的示意图。
[0027]图3是用于将转运蛋白插入Reb M菌株的着陆垫(landing pad)DNA构建体的示意图。构建体的每一端均包含来自酵母SFM1基因下游的500bp DNA序列，以促进此基因座处的同源重组。在此基因座处插入着陆垫不会删除任何基因。着陆垫包含全长GAL1启动子，然后是F
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CphI核酸内切酶的识别位点及来自原生酵母基因HEM13的终止子。
[0028]图4是上清液中存在的Reb D+Reb M的百分比图表。具有不同过表达转运蛋白的酵母菌株均在微量滴定板中生长。此图报告了去除细胞后在上清液中检测到的Reb D+Reb M(以微摩尔为单位)的百分比。亲本菌株不包含过表达的转运蛋白。将上清液中测得的Reb D+Reb M的量除以全细胞培养液中测得的Reb D+Reb M的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.能够生成一种或多种甜菊糖苷(steviol glycoside)的经遗传修饰的宿主细胞，所述经遗传修饰的宿主细胞包含编码ABC转运蛋白的异源核酸，所述ABC转运蛋白包含与选自由下列组成的组的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、和SEQ ID NO：30。2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有选自由下列组成的组的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8。3.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含核酸，所述核酸编码香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)、内根
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柯巴基焦磷酸合酶(ent
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copalyl pyrophosphate synthase，CPS)、内根
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贝壳杉烯合酶(ent
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kaurene synthase，KS)、内根
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贝壳杉烯19
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氧化酶(ent
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kaurene 19
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oxidase，KO)、内根
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异贝壳杉烯酸13
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羟化酶(ent
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kaurenoic acid 13
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hydroxylase，KAH)、细胞色素p450还原酶(CPR)、以及一种或多种UDP
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葡萄糖基转移酶(UGT)。4.根据权利要求3所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种UDP
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葡萄糖基转移酶(UGT)选自由下列组成的组：UGT85C2、UGT74G1、UGT91D_like3、UGT76G1、EUGT11、和UGT40087。5.根据权利要求4所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)包含与SEQ ID NO：9具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，所述内根
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柯巴基焦磷酸合酶(CPS)包含与SEQ ID NO：10具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，所述内根
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贝壳杉烯合酶(KS)包含与SEQ ID NO：11具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，所述内根
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贝壳杉烯19
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氧化酶(KO)包含与SEQ ID NO：12具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，所述内根
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异贝壳杉烯酸13
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羟化酶(KAH)包含与SEQ ID NO：13具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，所述细胞色素p450还原酶(CPR)包含与SEQ ID NO：14具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，和所述一种或多种UDP
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葡萄糖基转移酶(UGT)包含与选自由下列组成的组的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19。6.根据权利要求5所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，所述内根
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柯巴基焦磷酸合酶(CPS)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，所述内根
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贝壳杉烯合酶(KS)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，所述内根
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贝壳杉烯19
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氧化酶(KO)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，所述内根
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异贝壳杉烯酸13
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羟化酶(KAH)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，所述细胞色素p450还原酶(CPR)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列，和所述一种或多种UDP
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葡萄糖基转移酶(UGT)包含选自由下列组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19。7.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞和植物细胞。8.根据权利要求7所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
9.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID NO：1的所述序列的氨基酸序列。10.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID NO：2的所述序列的氨基酸序列。11.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID NO：3的所述序列的氨基酸序列。12.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID NO：4的所述序列的氨基酸序列。13.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID NO：5的所述序列的氨基酸序列。14.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID NO：6的所述序列的氨基酸序列。15.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID NO：7的所述序列的氨基酸序列。16.根据权利要求15所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含相对于SEQ ID NO：7的所述氨基酸序列的一个或多个氨基酸置换。17.根据权利要求16所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述一个或多个氨基酸置换选自V666A、Y942N、L956P、和E1320V。18.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID NO：8的所述序列的氨基酸序列。19.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述ABC转运蛋白包含具有SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：发明
国别省市：