改进的乙酰-COA羧化酶变体制造技术

本公开涉及乙酰-CoA羧化酶(ACC)变体和表达它们的宿主细胞，用于生产包括脂肪酸衍生物的丙二酰-CoA衍生化合物。进一步涉及生产增加量的丙二酰-CoA衍生化合物的方法和相关的细胞培养物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对相关申请的交叉引用本申请要求2013年9月13日提交的美国临时申请No.61/877418和2013年10月17日提交的美国临时申请No.61/892242的利益，在此通过引用将它们的全部公开内容合并入本文。序列表本申请含有序列表，所述序列表已通过EFS-Web以ASCII形式提交，通过引用将该序列表的全文合并入本文。所述ASCII拷贝于2014年9月12日建立，名为LS00050PCT_SL.txt，大小为128,259字节。
本公开涉及用于生产丙二酰-CoA衍生化合物的乙酰-CoA羧化酶(ACC)变体，所述丙二酰-CoA衍生化合物包括脂肪酸衍生物。进一步涉及表达ACC变体的宿主细胞和相关的细胞培养物。还包括通过使用表达ACC变体的宿主细胞生产丙二酰-CoA衍生化合物的方法。
技术介绍
石油是地球上发现的液体、气体或固体形式的有限的天然资源。但是，开发石油产品的成本相当大，不管是在财政上还是在环境上。从地球开采的天然形式的原油几乎没有商业用途。它是不同长度和复杂度的碳氢化合物，例如链烷烃(或烷)，烯烃(或烯)，炔，环烷烃(或环烷)，脂肪族化合物，芳香族化合物等的混合物。此外，原油含有其它有机化合物(例如含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如硫、盐、酸、金属等)。由于其高能量密度及其易于运输性，大部分石油被精炼成燃料，例如运输燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)，燃料油，液化石油气等。石化产品可用于制造专用化学品，例如塑料、树脂、纤维、弹性体、药物、润滑剂或凝胶。专用化学品具有许多商业用途。可以由石化产品原料生产的专用化学品的实例包括脂肪酸、碳氢化合物(例如长链碳氢化合物、支链碳氢化合物、饱和碳氢化合物、不饱和碳氢化合物等)、脂肪醇、脂肪酯、脂肪醛、酮、润滑剂等。脂肪酸在商业上被用作表面活性剂。表面活性剂可以，例如在去垢剂和肥皂中找到。脂肪酸还可以被用作燃料、润滑油、涂料、油漆、蜡烛、起酥油、化妆品和乳化剂中的添加剂。此外，脂肪酸在橡胶产品中被用作加速活化剂。脂肪酸还可以被用作给料，以生产甲酯、酰胺、胺、酰基氯、酸酐、乙烯酮二聚体、过氧酸和酯。脂肪酯具有许多商业用途。例如，生物柴油，一种替代燃料，由酯(例如脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)等)组成。一些低分子量的酯是易挥发的，具有令人愉悦的气味，这使它们可以用作香料或调味剂。此外，酯可用作油漆、涂料和清漆的溶剂。而且，一些天然存在的物质，例如蜡、脂肪和油，是由酯组成的。酯还可以用作树脂和塑料中的软化剂，汽油和油中的增塑剂、阻燃剂和添加剂。此外，酯可以用来制造聚合物、薄膜膜、纺织品、染料和药物。类似地，脂肪醇具有许多商业用途。例如，脂肪醇和它们的衍生物在全球每年的销售超过十亿美元。短链脂肪醇在化妆品和食品工业中用作乳化剂、润肤剂和增稠剂。由于其两性性质，脂肪醇表现为非离子型表面活性剂，它们在个人护理用品和日用品中是有用的，例如去垢剂。此外，脂肪醇用于蜡、胶、树脂、药液、润滑油添加剂、纺织品抗静电和整理剂、增塑剂、化妆品、工业溶剂和用于脂肪的溶剂中。乙酰CoA羧化酶(ACC)在调节脂肪酸合成和降解中具有重要的作用。它是依赖于生物素的酶复合物，催化脂肪酸生物合成的第一个关键步骤，即乙酰-CoA的不可逆羧化形成丙二酰-CoA。ACC通过它的两种催化活性，即生物素羧化酶(BC)和羧基转移酶(CT)产生丙二酰-CoA。在大部分原核生物中，ACC是多亚基酶，包括四个多肽(亚基)，它们由不同的基因编码，它们的协调表达通过多水平上的调控来控制(Cronanetal.(2002)ProgressinLipidResearch41:407-435；Jamesetal.(2004)JournalofBiologicalChemistry279(4):2520-2527)。ACC的四个多肽以固定的比例组装成复合物(Broussardetal.(2013)Structure21:650-657)。更具体地说，ACC反应需要四种蛋白，即生物素羧化酶(BC)、生物素基(或生物素)羧基载体蛋白(BCCP)和两个形成羧基转移酶(CT)的蛋白。可以通过依赖于ATP的酸不稳定的NaH14CO3向酸稳定的丙二酸的转化来测定整个ACC反应。细菌和植物质体的ACC亚基之间存在相似性和差异。但是，尽管植物蛋白的复杂度高，其ACC活性所必不可少的序列与细菌同源物之间没有明显差异(Cronanetal.，见上文)。已报道大肠杆菌ACC是已知ACC酶中最不稳定的。仅在所有四个亚基都以高浓度存在时才能测量整体活性，虽然在稀释蛋白溶液中可以测量两个分步反应。稳定复合物被认为是BC复合物和CTα2β2复合物。全长BCCP已被纯化为二聚体，并且有迹象表明存在不稳定的BC2-BCCP2复合物。其它细菌ACCs似乎比大肠杆菌ACCs更稳定，且可以在幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)和香茅醇假单胞菌(Pseudomonascitronellolis)的稀释提取物中测量ACC活性。此外，植物质体ACCs似乎比大肠杆菌ACCs更稳定。但是，与大肠杆菌一样，完整酶的进一步纯化导致解离和ACC活性的损失，ACC活性可以通过混合含有部分反应活性的级分而恢复。子复合物是BC-BCCP和CT，且没有证据表明存在游离的完整BCCP或游离的CTβ，这表明BCCP和CTβ当游离于溶液中时被降解了(Cronanetal.，见上文)。包括accA、accB、accC和accD在内的大肠杆菌acc基因的鉴别有利于研究ACC蛋白。辐射自杀筛选(Radiationsuicideselections)已被用于分离脂肪酸合成中的突变体，包括在分别编码ACC亚基BCCP和CTβ的基因accB和accD上的突变体。accB突变体已经被更广泛地研究，突变G133S对温度敏感生长起决定作用。这种突变导致生物素域(biotinoyldomain)内的空间位阻(stericclash)。得到的这种突变蛋白在较高的温度下容易变性，并因此对细胞内蛋白酶敏感。突变BCCP株在30–C生长时，仅有正常水平的大约25％的BCCP，但是生长速率和脂肪酸合成是正常的(Cronanetal.，见上文)。但是，已知增加ACC的所有四种蛋白的浓度可以在某种程度上改善通过脂肪酸合成的通量(Davisetal.(2000)JournalofBiologicalChemistry275(37):28593-28598)。相反，已显示大肠杆菌ACC可以被ACP的酰化衍生物抑制，而缺少酰基部分的A本文档来自技高网...

【技术保护点】
在其氨基酸序列中包含至少一个突变的变体生物素羧基载体蛋白(BCCP)，其中所述变体BCCP包含选自由SEQ ID NOS:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88和90组成的组的多肽序列，并且其中当与相应的野生型细胞相比，所述变体BCCP的表达赋予重组细胞增加的丙二酰‑CoA‑衍生化合物的生产。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.13 US 61/877,418;2013.10.17 US 61/892,2421.在其氨基酸序列中包含至少一个突变的变体生物素羧基载体蛋白(BCCP)，其中所述
变体BCCP包含选自由SEQIDNOS:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、
38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88
和90组成的组的多肽序列，并且其中当与相应的野生型细胞相比，所述变体BCCP的表达赋
予重组细胞增加的丙二酰-CoA-衍生化合物的生产。
2.权利要求1的变体BCCP，其中所述突变在N-末端氨基酸区域中。
3.权利要求2的变体BCCP，其中所述突变在SEQIDNO:2的氨基酸位置2上。
4.权利要求1的变体BCCP，其中所述变体BCCP包含SEQIDNO4或SEQIDNO:6。
5.权利要求1的变体BCCP，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物包含任何一种脂肪酸的脂
肪酸衍生物、脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)、脂肪醇、脂肪胺、β羟基脂肪酸衍生物、
双功能脂肪酸衍生物和不饱和脂肪酸衍生物。
6.权利要求4的变体BCCP，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物是FAME。
7.权利要求1的变体BCCP，其中所述BCCP由变体accB基因编码。
8.权利要求7的变体accB基因，其中所述变体accB基因包含选自由SEQIDNOS:3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、42、43、45、47、49、50、51、53、55、
57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和89组成的组的核酸序列。
9.包含权利要求1-8任一项的变体BCCP的重组微生物。
10.生产丙二酰-CoA-衍生化合物的方法，包括在含有碳源的发酵液中培养权利要求9
的重组微生物。
11.权利要求10的方法，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物包含任何一种脂肪酸的脂肪
酸衍生物、脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)、脂肪醇、脂肪胺、β羟基脂肪酸衍生物、双
功能脂肪酸衍生物和不饱和脂肪酸衍生物。
12.权利要求11的方法，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物是FAME。
13.控制BCCP表达的变体操纵子，其中所述操纵子导致与野生型微生物细胞相比，重组
微生物细胞中BCCP表达的变化。
14.权利要求13的变体操纵子，其中当与相应的野生型微生物细胞相比时，所述操纵子
赋予所述重组微生物细胞提高的丙二酰-CoA-衍生化合物的生产。
15.权利要求14的变体操纵子，进一步包含选自由异源启动子、异源启动子变体、合成
启动子、基因修饰的accBC启动子、天然存在的大肠杆菌启动子和大肠杆菌启动子变体组成
的组的启动子。
16.权利要求15的变体操纵子，其中所述基因修饰的accBC启动子是accBC启动子变体。
17.权利要求15的变体操纵子，其中所述异源启动子是T5启动子或T5启动子变体。
18.权利要求17的变体操纵子，其中所述T5启动子变体选自SEQIDNOS:93、94、95和96
的任一个。
19.包含权利要求13-18任一项的变体操纵子的重组微生物。
20.生产丙二酰-CoA-衍生化合物的方法，包括在含有碳源的发酵液中培养权利要求19
的重组微生物。
21.权利要求20的方法，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物包含任何一种脂肪酸的脂肪
酸衍生物、脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)、脂肪醇、脂肪胺、β羟基脂肪酸衍生物、双
功能脂肪酸衍生物和不饱和脂肪酸衍生物。
22.权利要求21的方法，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物是FAME。
23.生产丙二酰-CoA-衍生化合物的方法，包括在含有碳源的发酵液中培养包含权利要
求1的变体BCCP和权利要求13的变体操纵子的重组微生物。
24.权利要求23的方法，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物包含任何一种脂肪酸的脂肪
酸衍生物、脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)、脂肪醇、脂肪胺、β羟基脂肪酸衍生物、双
功能脂肪酸衍生物和不饱和脂肪酸衍生物。
25.权利要求24的方法，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物是FAME。
26.包含在其氨基酸序列中具有至少一个突变的变体生物素羧基载体蛋白(BCCP)的重
组微生物，其中所述变体BCCP的表达给所述重组微生物赋予增加的丙二酰-CoA-衍生化合
物的生产，并且其中所述变体BCCP在N-末端氨基酸区域中具有突变。
27.权利要求26的重组微生物，其中所述变体BCCP包含SEQIDNO:6。
28.权利要求26的重组微生物，其中所述变体BCCP包含SEQIDNO:4或SEQIDNO:8。
29.权利要求26的重组微生物，其中所述变体BCCP包含SEQIDNO:10或SEQIDNO:12。
30.权利要求26的重组微生物，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物选自由脂肪酸衍生
物、脂肪酸、脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)、脂肪醇、脂肪胺、β羟基脂肪酸衍生物、
双功能脂肪酸衍生物和不饱和脂肪酸衍生物组成的组。
31.权利要求30的重组微生物，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物是FAME。
32.权利要求30的重组微生物，其中所述重组微生物是重组微生物细胞。
33.权利要求32的重组微生物，其中所述重组微生物细胞选自由埃希氏杆菌属、芽孢杆
菌属、蓝藻门、乳杆菌属、发酵单胞菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉属、木霉属、脉孢菌属、
镰刀菌属、腐质霉属、根毛霉属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、毛霉属、蚀丝霉属、青霉属、
显革菌属、侧耳属、栓菌属、金孢霉属、酵母属、寡养单胞菌属、裂殖酵母属、耶氏酵母属和链
霉菌属组成的组。
34.权利要求33的重组微生物，其中所述埃希氏杆菌属是大肠杆菌。
35.权利要求33的重组微生物，其中所述蓝藻门选自由原绿球藻、聚球藻、集胞藻、蓝杆
藻和点状念球藻组成的组。
36.权利要求35的重组微生物，其中所述蓝藻门选自由细长聚球藻PCC7942、集胞藻
PCC6803和聚球藻PCC7001组成的组。
37.包含改变的核酸序列的表达的重组微生物，所述核酸序列包含accB或accC或它们
的组合。
38.权利要求37的重组微生物，其中所述改变的表达是增加的或减少的表达。
39.权利要求38的重组微生物，其中所述增加的表达导致当在有碳源的条件下培养所
述微生物时，丙二酰-CoA衍生化合物的生产增加。
40.权利要求37的重组微生物，其中所述改变的表达是由驱动所述核酸序列的表达的
一个或多个启动子的改变导致的。
41.权利要求37的重组微生物，其中所述核酸序列编码生物素羧基载体蛋白(BCCP)或
生物素羧化酶(BC)或它们的组合。
42.权利要求37的重组微生物，其中所述丙二酰-CoA-衍生化合物选自由脂肪酸衍生
物、脂肪酸、脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)、脂肪醇、脂肪胺、β羟基脂肪酸衍生物、
双功能脂肪酸衍生物和不饱和脂肪酸衍生物组成的组。
43.权利要求37的重组微生物，其中所述重组微生物细胞选自由埃希氏杆菌属、芽孢杆
菌属、蓝...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·L·格林菲尔德，D·E·特林巴尔，A·W·席尔默，C·常，B·贝罗兹安，J·温格，
申请(专利权)人：REG生命科学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US