本发明专利技术提供一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括：定点突变詹氏甲烷球菌的酪氨酸‑tRNA合成酶获得MjpPpaRS基因，将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS；将重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS和pUC‑MjtRNA转化至大肠杆菌BL21，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；以pIVEX2.4c‑AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变；向无细胞表达体系中添加去污剂可溶表达编入pPpa的AQPZ蛋白，利用亲和层析纯化获得定点编入pPpa的AQPZ蛋白。本发明专利技术利用大肠杆菌无细胞体系生产编入pPpa的AQPZ蛋白并利用亲和层析纯化获得该目标蛋白，非天然氨基酸的嵌入使得该水通道蛋白与磷脂的亲和性增强，使得相同的条件下水通道蛋白的嵌入后更稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工领域，特别涉及一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法。
技术介绍
生物体由64个密码子来编码20种天然氨基酸和3个终止信号。由于20种天然氨基酸所含的功能基团有限，无法满足生物科学、化学研究和应用中对蛋白质结构和功能的需求。基因编码非天然氨基酸技术已可将70多种非天然氨基酸成功编码蛋白质，某些非天然氨基酸的加入可增强蛋白性能、稳定蛋白结构、甚至产生新的功能。这些UAAs含有酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸酮基、醛基、叠氮、炔基和烯基等多样性功能基团，可进行多种修饰反应，如光化学、糖基化和荧光显色等反应，从而使得基因编入非天然氨基酸技术被广泛应用。无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。相对于体内表达体系，大肠杆菌无细胞体系可以很好的解决膜蛋白表达引起的细胞毒性问题。大肠杆菌水通道蛋白Z(AQPZ)属于水通道蛋白中的orthodox aquaporin亚族，透水性和选择性都非常高。由于AQPZ来自于大肠杆菌，相对于来源于哺乳动物细胞的水通道蛋白更易于在大肠杆菌中进行表达，因此对AQPZ的制备和膜过滤应用研究受到更为广泛关注。传统生物仿生膜以流动镶嵌模式将AQPZ嵌入两亲性双嵌段聚合物或天然磷脂双分子层中，但这种以疏水作用嵌入的水通道蛋白较易流失，从而影响整个膜的使用性能与寿命。本专利将非天然氨基酸基因编入AQPZ水通道蛋白，为含水通道蛋白的生物仿生膜制备提供蛋白基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得MjpPpaRS基因(SEQ NO.1)，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine,pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得重组质粒p15a-MjpPpaRS；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA。(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转至大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到重组质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4c-AqpZTAG加入步骤(2)获得的大肠杆菌无细胞体系中表达；(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。本专利技术在水通道蛋白AQPZ中定点基因编入非天然氨基酸pPpa，打破水通道蛋白在天然氨基酸的局限，为多样的生物仿生膜制备方法提供更为丰富蛋白基础，扩宽思路。因编入pPpa的AQPZ蛋白的高疏水性会对大肠杆菌细胞产生的毒害作用，导致编入pPpa的AQPZ蛋白在大肠杆菌体内难以表达，利用大肠杆菌无细胞体系开放性的特点可有效避免目标蛋白对宿主细胞的损害；通过向大肠杆菌无细胞体系中添加去污剂，提高目标蛋白的可溶性表达效率，利用pIVEX2.4c-AqpZTAG所带的6his亲和标签，可以高效的利用亲和层析纯化编入pPpa的AQPZ蛋白重组蛋白，为制备高稳定性的生物仿生膜提供了蛋白基础。附图说明图1：载体pIVEX2.4c-AqpZTAG结构示意图。图2：无细胞体系表达pPpa编入的AQPZ的电泳图；Lane 1：蛋白markers；Lane 2：不添加pPpa的表达沉淀；Lane 3：不添加pPpa的表达上清；Lane 4：添加pPpa沉淀；Lane 5：添加pPpa上清；Lane 6：阴性对照沉淀；Lane 7：阴性对照上清；Lane 8：加pPpa和pIVEX2.4c-MjpPpaRS沉淀；Lane 9：加pPpa和pIVEX2.4c-MjpPpaRS上清。图3：停留光谱光散射测定AQPZ和P-AQPZ的透水效率。具体实施方式本专利技术的转化细胞通过公知的氯化钙法制得。上述载体通过公知的热击法导入感受态细胞。无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。本专利技术所涉及的无细胞体系是按实例中所描述的方法制备。蛋白中含有6his亲和标签，可使用亲和层析进行纯化。基于以上原理，一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法包括以下步骤：(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得MjpPpaRS基因(SEQ NO.1)，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine,pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得重组质粒p15a-MjpPpaRS；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA。(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转化大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；AqpZTAG的基因序列见SEQ NO.3。(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4c-AqpZTAG加入步骤(3)获得的大肠杆菌无细胞体系中表达；(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1，MjpPpaRS基因的获得，包括以下步骤：1.以p15a-MjtyrRS为模板，利用RS F2/RS R4和RS F4/RS R2两对引物通过PCR扩增获得两个DNA片段，将这两个DNA片段同源重组得到含三个位点突变(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala)的氨酰tRNA合成酶质粒。以上述突变质粒为模板，利用RS F1/RS R3和RS F3/RS R1两对引物，进行第二本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：（1）定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸‑tRNA合成酶(tyrosyl‑tRNA synthetase, TyrRS)，获得MjpPpaRS基因，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基‑L‑苯丙氨酸(p‑propargyloxyphenylalanine, pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得p15a‑MjpPpaRS质粒；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC‑MjtRNA；（2）将步骤（1）得到的质粒p15a‑MjpPpaRS和pUC‑MjtRNA同时转至大肠杆菌BL21 (DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；（3）将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，获得重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS；（4）以pIVEX2.4c‑AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到重组质粒pIVEX2.4c‑AqpZTAG；（5）将步骤（3）得到的重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS和步骤（4）得到的载体pIVEX2.4c‑AqpZTAG加入步骤（2）获得的大肠杆菌无细胞体系中进行表达；（6）利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。...
【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：（1）定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase, TyrRS)，获得MjpPpaRS基因，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine, pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得p15a-MjpPpaRS质粒；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA；（2）将步骤（1）得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtR...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志南，庄冰佳，唐云平，蔡谨，黄磊，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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