用于稳定生产乙酰辅酶A衍生化合物的方法技术

本公开涉及用于在微生物宿主细胞中产生异源非异化化合物的开关的用途。一方面，本文中提供的是，当在需氧条件，随后在微需氧条件下连续培养时，更加稳定地产生非异化化合物的经遗传修饰的微生物体，以及通过在这样的培养条件下培养该经遗传修饰的微生物来产生非异化化合物的方法。另一方面，本文中提供的是，当在麦芽糖存在、随后在麦芽糖减少或不存在下连续培养时，更加稳定地产生非异化化合物的经遗传修饰的微生物体，以及通过在这样的培养条件下培养该经遗传修饰的微生物来产生非异化化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】1.
本公开涉及作为基因开关的氧响应启动子的用于通过遗传修饰的宿主细胞调节异源性非异化(non-catabolic)化合物的产生的用途。2.专利技术背景合成生物学的出现带来了以产业规模和质量从可再生能源进行发酵性微生物生产生物燃料、化学品和生物材料的希望。例如，功能性的非天然生物途径已经成功地在微生物宿主进行构建，用于生产抗疟疾药物青蒿素的前体(参见，例如，Martin等,Nat Biotechnol 21:796-802(2003)；fatty acid derived fuels and chemicals(例如，脂肪酸酯，脂肪醇和蜡；参见，例如，Steen等,Nature 463:559-562(2010)；制作胆固醇降低药物的聚酮合酶(polyketide synthases that make cholesterol lowering drugs)(参见，例如，Ma等,Science 326:589-592(2009)；和聚酮类(参见，例如，Kodumal,Proc Natl Acad Sci USA 101:15573-15578(2004)。然而，合成生物学的商业成功在很大程度上将取决于是否能使再生制品的生产成本与它们各自的不可再生对应物的生产成本竞争或胜过它们各自的不可再生对应物的生产成本。菌株稳定性可以是工业发酵成本的主要驱动力，因为它影响可以高效运行的连续发酵的时间长度。菌株稳定性通常是指微生物在延长的培养时间内维持非异化发酵产物的有利生产特征(即，高产率(克(化合物)/克(底物))和生产率(克/升(发酵液)/小时)的能力。具体地，遗传稳定性是生产随着时间的推移而与生产产物相关的基因的预期等位基因频率几乎没有任何改变的微生物群体的倾向，其在产物的持续输出上起着主要作用。对于除生物质(根据定义，这种产品消耗新陈代谢能量和碳，否则其会用于生产更多的细胞)之外产物的非异化发酵，不稳定的基础是双重的：进化突变和选择。首先，失去生产的突变自发并随机产生。第二，产量减少的细胞的增长速度或“适应力(fitness)”优势导致低生产者席卷最终群体，从而降低了整个培养性能。这种现象可以被称为“菌株退化”。很长一段时间，巴西燃料乙醇发酵获得了极高产率的来自糖的乙醇，即约90％的最大理论产率。这某种程度上因为乙醇的生产是分解代谢的：其生成2ATP/分子产生的糖且其为没有氧参与的氧化还原平衡。变异成不生产乙醇的细胞在发酵罐的低氧条件下适应力较低且也不会席卷该群体。这允许工业乙醇发酵在整个时期回收大多数酵母生物质，从而使最少的糖转化成酵母细胞生物质并且引导几乎所有的糖进行乙醇生产。这种扩展繁殖和生物质再利用增加了乙醇生产的效率：运营支出减少，因为在每个周期更少的糖转变为生物质(即产率上升)；和资本支出减少，因为只需要较少和较小的发酵罐来构建用于接种的生物质。与此相反，许多乙酰辅酶A衍生烃类(例如，类异戊二烯、脂肪酸和聚酮类)的生产事实上通常是非异化的；它们通常需要ATP、NADPH和碳的净输入，经常利用大量氧气的供给来帮助平衡系统的氧化还原。这样的环境使得进化朝向更低的产物、产生更有利基因型的更高生物质，并导致较高速率的菌株退化。降低生产非异化产物的负选择压力的一种方式是在不需要产物的周期内切断产物的形成，例如，在发酵阶段，在该阶段必须产生生物质以便使发酵罐生产力最大化。因此，本领域需要开关，其可以在发酵过程中控制生产乙酰辅酶A衍生化合物的时间。3.
技术实现思路
本文提供了从遗传修饰的宿主细胞生产异源性非异化化合物的发酵方法。在一些实施方案中，所述方法包括两个阶段：构建阶段，在该阶段期间，非异化化合物的生产大幅减少(“关”阶段)，而细胞生物质累积；和生产阶段，在该阶段期间，非异化化合物的生产打开。因此，与非异化化合物生产相关联的负选择压力在不需要生产的发酵阶段减轻。在构建阶段，非异化化合物生产的减少或消除使得(i)在构建阶段细胞的生长速率提高；和(ii)在生产阶段菌株生产稳定性提高。这将导致更长的持续非异化化合物的生产，从而增加了菌株的总产率和/或生产率。有利的是，本文所提供的发酵方法中的非异化化合物生产状态的“关”和“开”，通过容易获得、价格适中并且工业相关的条件控制。在一个方面，发酵培养中的非异化化合物生产状态的“关闭”和“打开”通过发酵中的氧水平进行控制，例如，在培养基中的溶解氧量连同使用氧敏感启动子，所述启动子驱动影响异源性非异化化合物生产的途径酶
的基因表达。这些方法利用下述观点，即当培养经改造成产生异源性非异化化合物的细胞时可以提供有限量的氧气。这些细胞可在微需氧条件下维持生长和活力，从而节省与运行完全需氧发酵过程相关的成本。在一些实施方案中，一旦宿主细胞群体达到足以使消耗氧气和供给氧气的速度一样的密度，则可以实现微需氧条件。有利的是，通过将途径基因表达结合到氧敏感启动子，只有当宿主细胞群的耗氧量高到足以实现在发酵罐内的微需氧条件时，化合物生产才被打开，其有效地发生在构建阶段结束时，也就是，当最佳细胞密度已经实现用于有效化合物的生产时。因此，途径基因的表达与实现群体密度紧密相关联，该群体密度对于生产阶段的开始是理想的。因此，本文提供的方法利用氧水平和基因开关来实现生产异源性非异化化合物的改进发酵方法的“开”和“关”阶段。因此，本文提供了用于在遗传修饰的宿主细胞内生产异源性非异化化合物的方法，所述方法包括：(a)需氧条件下，在包含碳源的培养基中培养遗传修饰的宿主细胞群体，其中所述宿主细胞包含编码用于制造异源性非异化化合物的酶途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸，其中所述一种或多种酶的表达由微需氧响应的启动子活性进行正调节，其中，所述需氧条件限制由宿主细胞产生的异源性非异化化合物的量；和(b)微需氧条件下，在包含碳源的培养基中培养所述群体或其亚群，其中所述微需氧条件增加了由所述群体或其亚群产生的非异化化合物。在一些实施方案中，微需氧响应启动子是突变的DAN1启动子。在一些实施方案中，所述突变的DAN1启动子包括选自SEQ ID NOs：1，2，3，4，5，6，7，8，9和10组成的组的序列。在一些实施方案中，所述突变的DAN1启动子序列包含SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，所述突变的DAN1启动子序列包括SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，微需氧响应启动子可操作地连接到编码酶途径的一种或多种酶的一种或多种异源性核酸，而所述微需氧条件增加酶途径的一种或多种酶的表达。在一些实施方案中，所述微需氧响应启动子可操作地连接到编码转录调控因子的异源核酸，所述转录调控因子正调节编码酶途径的一种或多种酶的一种或多种异源性核酸的表达，且所述微需氧条件增加所述转录调控因子的表达。在一些实施方案中，所述转录调控因子是Gal4p，且编码酶途径的一种或多种酶的一种或多种异源性核酸均可操作地连接到Gal4p-响应启动子，所述启动子选自pGAL1、pGAL7和pGAL10
组成的组。在一些实施方案中，宿主细胞还包含Gal80p的功能性破坏。在一些实施方案中，微需氧条件包括在培养基中的溶解氧浓度小于约20％，小于约15％，小于约10％或小于约5％。在一些实施方案中，微需氧条本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在经遗传修饰的宿主细胞中产生异源非异化化合物的方法，所述方法包括：(a)在包含含有麦芽糖的碳源的培养基中，培养经遗传修饰的宿主细胞的群体，其中所述宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸编码用于生成所述异源非异化化合物的酶途径的一种或多种酶，其中所述一种或多种酶的表达受麦芽糖响应启动子的活性负调节，其中所述培养基中的麦芽糖的存在限制由所述宿主细胞产生的异源非异化化合物的量；和(b)在包含碳源的培养基中，培养所述群体或其亚群，其中麦芽糖不存在或处于足够低的量，使得麦芽糖响应启动子不再有活性，和增加通过宿主细胞产生的异源非异化化合物的产量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于在经遗传修饰的宿主细胞中产生异源非异化化合物的方法，所述方法包括：(a)在包含含有麦芽糖的碳源的培养基中，培养经遗传修饰的宿主细胞的群体，其中所述宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸编码用于生成所述异源非异化化合物的酶途径的一种或多种酶，其中所述一种或多种酶的表达受麦芽糖响应启动子的活性负调节，其中所述培养基中的麦芽糖的存在限制由所述宿主细胞产生的异源非异化化合物的量；和(b)在包含碳源的培养基中，培养所述群体或其亚群，其中麦芽糖不存在或处于足够低的量，使得麦芽糖响应启动子不再有活性，和增加通过宿主细胞产生的异源非异化化合物的产量。2.如权利要求1所述的方法，其中所述麦芽糖响应启动子与编码转录调控因子的异源核酸可操作地连接，所述转录调控因子负调节该编码酶途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸的表达，且在步骤(a)中的麦芽糖增加所述转录调控因子的表达。3.如权利要求2所述的方法，其中所述转录调控因子是Gal80p，所述宿主细胞还包含Gal4p，且编码所述酶途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸各自可操作地连接到Gal4p响应启动子，所述Gal4p响应启动子选自pGAL1、pGAL7和pGAL10组成的组。4.用于在经遗传修饰的宿主细胞中产生异源类异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在包含含有麦芽糖的碳源的培养基中培养经遗传修饰的宿主细胞的群体，其中所述宿主细胞包含：(iv)编码甲羟戊酸(MEV)途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸各自可操作地连接到Gal4p响应启动子，所述Gal4p响应启动子选自pGAL1、pGAL7和pGAL10组成的组；和(v)编码Gal4p的核酸；和(vi)编码Gal80p的核酸，所述核酸可操作地连接到麦芽糖响应启动子；其中，在培养基中的麦芽糖限制由所述宿主细胞产生的异源类异戊二烯的量；和(b)在包含碳源的培养基中培养所述群体或其亚群，其中麦芽糖不存在
\t或处于足够低的量，使得麦芽糖响应启动子不再有活性，和增加通过宿主细胞产生的异源非异化化合物的产量。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述麦芽糖响应启动子包含选自下述所组成的组的序列：pMAL1(SEQ ID NO：12)、pMAL2(SEQ ID NO：13)、pMAL11(SEQ ID NO：14)、pMAL12(SEQ ID NO：15)、pMAL31(SEQ ID NO：16)和pMAL32(SEQ ID NO：17)。6.如权利要求5所述的方法，其中所述麦芽糖响应启动子序列包括pMAL32(SEQ ID NO：17)。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述培养基包含至少0.1％(w/v)的麦芽糖。8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述培养基包含0.25％至3％(w/v)的麦芽糖。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基包含的麦芽糖不超过0.08％(w/v)。10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在步骤(b)培养的期间里通过所述经遗传修饰的宿主细胞的群体的异源非异化化合物的产量，与酶途径的一种或多种酶的表达不受所述麦芽糖响应启动子的活性限制的发酵方法中实现的异源非异化化合物的产量相比，得到提高。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤(a)期间的所述非异化化合物的产量小于步骤(b)期间的所述非异化化合物的产量的50％、40％、30％、20％或10％。12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述培养为至少12、24、36、48、60、72、84、96或超过96小时的时间段。13.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述培养为足以使所述群体达到0.01至400的细胞密度(OD600)的时间段。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养为3至20天的时间段。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自真菌细胞、细菌细胞、植物细胞和动物细胞所组成的组。16.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为酵母细胞。17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述非异化化合物的产量是根据收率(每克碳底物产生的非异化化合物的克数)或生产率(每
\t升培养基每小时产生的非异化化合物的克数)测量的。18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括回收所述非异化化合物。19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述非异化化合物选自由下述所组成的组：氨基酸、脂肪酸、类异戊二烯、和聚酮。20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能够产生类异戊二烯且包含编码类异戊二烯途径的酶的至少一种异源核酸，所述类异戊二烯途径的酶选自由下述所组成的组：(i)缩合两分子乙酰辅酶A以形成乙酰乙酰辅酶A的酶；(ii)缩合乙酰乙酰辅酶A与另一分子乙酰辅酶A以形成3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)的酶；(iii)将HMG-CoA转变成甲羟戊酸的酶；(iv)将甲羟戊酸转变成甲羟戊酸5-磷酸的酶；(v)将甲羟戊酸5-磷酸转变成甲羟戊酸5-焦磷酸的酶；(vi)将甲羟戊酸5-焦磷酸转变成IPP的酶；(vii)将IPP转变成DMAPP的酶；(viii)能缩合IPP和/或DMAPP分子以形成含超过五个碳的聚异戊二烯化合物的聚异戊二烯合酶；(ix)缩合IPP与DMAPP而形成GPP的酶；(x)缩合两分子IPP与一分子DMAPP的酶；(xi)缩合IPP与GPP而形成FPP的酶；(xii)缩合IPP和DMAPP而形成GGPP...

【专利技术属性】
技术研发人员：佩内洛普·R·蔡，亚当·梅多斯，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，道达尔市场服务公司，
类型：发明
国别省市：美国;US