使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用制造技术

本发明专利技术涉及使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用。本发明专利技术涉及通过在稳定辅酶的存在下贮藏酶用于使酶稳定的方法。此外，本发明专利技术涉及使用稳定辅酶稳定的酶及其在用于检测分析物的测试元件中的用途。

【技术实现步骤摘要】
使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用 本申请是国际申请日为2009年2月19日的国际申请PCT/EP2009/001206进入中 国、申请号为200980105640. 6的题为使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用的专利技术专利申请 的分案申请。
本专利技术涉及通过在稳定辅酶的存在下贮藏酶使酶稳定的方法。本专利技术进一步涉及 用稳定辅酶稳定的酶，及其在用于检测分析物的测试元件中的用途。
技术介绍
生物化学测量系统是临床相关的分析方法的重要组成成分。本文优先考虑的事是 测量分析物例如代谢物或底物，其借助于酶直接或间接进行测定。分析物在这种情况下借 助于酶_辅酶复合物进行转变，并且随后进行定量。这需要待测定的分析物与合适的酶和 辅酶接触，其中酶通常以催化量使用。辅酶通过酶促反应得到改变，例如被氧化或还原。这 个过程可以直接，或通过介质电化学或光度测定地进行检测。校准提供量度和待测定的分 析物浓度之间的正相关关系。 辅酶是与酶共价或非共价结合，并且通过分析物的转变而改变的有机分子。辅酶 的突出例子分别是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，由 其通过还原分别产生NADH和NADPH。 现有技术中已知的测量系统因对于有限时间段稳定，以及为了达到这种稳定性对 环境的特定需求例如冷却贮藏或干燥贮藏而著称。对于具体应用，例如由最终用户自身执 行的测试，例如在血糖的自我监控中，通过不正确、不引人注意的错误贮藏发生不正确的结 果因此是可能的。通过主要包装打开太长时间的干燥剂耗尽特别可能导致错误测量，这对 于一些系统几乎不会被用户鉴别出。 用于增加生物化学测量系统的稳定性的一种已知措施是使用稳定的酶，例如使用 来自嗜热生物的酶。进一步的可能性是通过化学修饰例如交联或通过诱变使酶稳定。此 夕卜，还可以添加酶稳定剂例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白，或可以在聚合物网络 中例如通过光聚合而封入酶。 还已进行通过使用稳定的介质来改善生物化学测量系统的稳定性的尝试。因此， 通过使用具有尽可能低的氧化还原电位的介质，测试的特异性增加，并且在反应过程中的 干扰被消除。然而，酶/辅酶复合物的氧化还原电位形成对于介质的氧化还原电位的下限。 低于这些电位，与介质的反应减慢或甚至停止。 可替代可能性也是使用不含介质的生物化学测量系统，其中例如存在辅酶例如辅 酶NADH的直接检测。然而，此种测量系统的一个缺点是辅酶例如NAD和NADP是不稳定的。 NAD和NADP是对碱不稳定的分子，其降解途径在文献中得到描述 (N. J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes,Academic Press New York, London 1982,编辑 J. Everese，B. Anderson，K. You，第 3 章，第 56-65 页）。NAD 和 NADP 的 降解通过切割核糖和吡啶单位之间的糖基键分别基本上导致ADP-核糖。另一方面还原型 NADH和NADPH是对酸不稳定的：例如，表异构化是一种已知的降解途径。在两种情况下， NAD/NADP和NADH/NADPH的不稳定性都来源于核糖单位和吡啶单位之间的糖基键的不稳定 性。然而，即使在不急剧的条件下，例如在水溶液中，辅酶NAD和NADP分别仅通过环境水分 而水解。这种不稳定性可能导致分析物测量中的不精确。 许多 NAD/NADP 衍生物例如在 B. M. Anderson in The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982,编辑 J. Everese，B. Anderson，K. You， 第4章中得到描述。然而，这些衍生物中的大多数不由酶良好接受。迄今为止因此已用于 诊断测试的唯一衍生物是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（乙酰NAD)，其在1956年首次得到 描述（N. 0. Kaplan，J. Biol.Chem. (1956)，221，823)。这种辅酶也显示由酶的弱接受和氧化 还原电位中的改变。 W0 01/94370描述了具有经修饰的吡啶基团的进一步NAD衍生物的使用。然而，烟 酰胺基团的修饰一般而言对催化反应具有直接影响。在大多数情况下，这种影响是负面的。 在关于稳定作用的进一步想法中，核糖单位已进行改变，以从而影响糖基键的稳 定性。这个程序不直接干扰烟酰胺基团的催化反应。然而，一旦酶显示出与核糖单位的 强烈和特异性结合，就可能存在间接影响。Kaufmann等人在这方面在W0 98/33936和US 5,801，006以及冊01/49247中分别公开了许多硫代核糖（也1〇1^13〇86)-隱0衍生物。然 而，迄今为止仍未显示出烟酰胺-核糖单位的修饰和衍生物在酶促反应中的活性之间的联 系。 不含糖基键的衍生物CarbaNAD在1988年首次得到描述（J. T. Slama， Biochemistry 1989, 27，183 和 Biochemistry 1989, 28, 7688)。其中的核糖由碳环糖单位 替换。尽管carbaNAD描述为脱氢酶的底物，但它的活性迄今为止仍未在临床上在生物化学 检测方法中得到证实。 类似方法随后由G. M. Blackburn，Chem. Comm.，1996, 2765进行描述，以用亚甲 基双膦酸盐化合物代替天然的焦磷酸盐制备carbaNAD。亚甲基双膦酸盐显示对于磷酸 酶增加的稳定性并且用作ADP-核糖基环化酶的抑制剂。水解稳定性中的增加不是目的 (J. T. Slama，G. M. Blackburn) 〇 WO 2007/012494 和 US 11/460, 366 分别公开了稳定的 NAD/NADH和 NADP/NADPH衍 生物，这些衍生物的酶复合物及其在生物化学检测方法和试剂盒中的用途。
技术实现思路
本专利技术所基于的目的是提供用于使酶稳定，特别是用于酶的长期稳定作用的方 法。 这个目的通过用于使酶稳定的方法来达到，其中酶在稳定辅酶的存在下进行贮 藏。已令人惊讶地发现借助于稳定辅酶，在高相对湿度或甚至在液相中和在升高的温度下 几周或几月的长期稳定作用是可能的。这个认识是令人惊讶的，因为已知尽管在天然辅 酶的存在下酶具有数小时的增加的短期稳定性（Bertoldi等人，Biochem. J. 389,（2005)， 885-898 ;van den Heuvel 等人，（J.Biol. Chem. 280(2005)，32115-32121;和 Pan 等人， (J. Chin. Biochem. Soc.第3卷（1974)，第1-8页），但它们显示在较长时间段期间的较低稳 定性（Nutrition Reviews 36 (1978)，251-254)。 与对于现有技术来说的这些认识相比较，令人惊讶的是，酶在稳定辅酶的存在下 具有比酶在天然辅酶的存在下显然增加的长期稳定性，这尤其是因为稳定辅酶对于酶具有 比天然辅酶更低的结合常数。 通过本专利技术的方法得到稳定的酶是辅酶依赖性酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于使酶稳定的方法，其特征在于所述酶在稳定辅酶的存在下进行贮藏，其中所述酶是选自下述的脱氢酶：葡糖脱氢酶(E.C.1.1.1.47)、乳酸脱氢酶(E.C.1.1.1.27、1.1.1.28)、苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)、甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)、醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1)、α‑羟丁酸脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶或氨基酸脱氢酶，例如L‑氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1.5)，且所述稳定辅酶是通式(II)的化合物其中A＝腺嘌呤、7‑脱氮腺嘌呤、8‑氮杂腺嘌呤或7‑脱氮‑8‑氮杂腺嘌呤，其中所述7‑脱氮变体可以任选在位置7中由卤素、C1‑C6‑炔基、C1‑C6‑链烯基或C1‑C6‑烷基取代，T＝在每种情况下是O，U＝在每种情况下是OH，V＝OH或磷酸基，或形成环状磷酸基的2个基团；W＝CONH2或COCH3，X1＝O，X2＝O，Y＝O，且Z＝通式(III)的化合物，其中在R5′和R5″之间存在单键，其中R4＝在每种情况下独立地是H、F、Cl、CH3，R5＝CH2，R5′＝CH2、CHOH或NH，R5″＝C(R4)2、CHOH或CHOCH3，R6＝CH或CCH3，且R6′＝CH或CCH3。...

【技术特征摘要】
2008.02.19 EP 08003054.71.用于使酶稳定的方法，其特征在于所述酶在稳定辅酶的存在下进行贮藏，其中所 述酶是选自下述的脱氢酶：葡糖脱氢酶（E.c.I. 1. 1.47)、乳酸脱氢酶（E.C.I. 1. 1.27、 I.I. 1. 28)、苹果酸脱氢酶（E.C.I.I. 1. 37)、甘油脱氢酶（E.C.I.I. 1. 6)、醇脱氢酶 (E.C.I.I. 1. 1)、α-羟丁酸脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶或氨基酸脱氢酶，例如L-氨基酸脱氢 酶（E.C. 1. 4. 1. 5)，且所述稳定辅酶是通式（II)的化合物其中 A=腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂腺嘌呤或7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，其中所述7-脱 氣变体可以任选在位置7中由齒素、C1-C6-块基、C1-C6-链稀基或C1-C6-烧基取代， T=在每种情况下是0， U=在每种情况下是0Η， V =OH或磷酸基，或形成环状磷酸基的2个基团； W=。0順2或COCH3， X1= 0， X2= 0， Y = 0,且 Z=通式（III)的化合物，其中在If和R5之间存在单键，其中R4 =在每种情况下独立地是H、F、Cl、CH3， R5=CH2, R5i =CH2、CHOH或NH， R5 =C(R4)2、CHOH或CHOCH3, R6=CH或CCH3，且R6' =CH或CCH3。2. 根据权利要求1的方法，其特征在于将葡糖脱氢酶用作酶。3. 根据权利要求1或2的方法，其中RY和R5各自是CHOH。4. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中RY是NH，并且R5是CH2。5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述稳定辅酶是carbaNAD。6. 根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶贮藏至少2周 的时间段。7. 根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于用稳定辅酶稳定的酶贮藏于至少 20 °C的温度下。8. 根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：D海因德尔，C霍恩，C加斯勒迪切，J霍内斯，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH