整合编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有至少一种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤（例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化）的多肽。本发明专利技术也涉及使用此类宿主细胞提高异丁醇、2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮的生物合成产量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及工业微生物和丁醇及其异构体的发酵生产领域。更具体地讲，本专利技术涉及具有一种或多种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。
技术介绍
丁醇是重要的工业化学品，其用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级提取剂。每年由石油化学方法生产了 100至120亿磅的丁醇，并且对这种通用化学品的需求还很可能会增加。2-丁酮，也被称为甲基乙基酮(MEK)，是被广泛使用的溶剂，并且是继丙酮之后最重要的商品化生产的酮。它被用作用于漆料、树脂和粘合剂的溶剂，以及选择性提取剂、氧化反应的活化剂，并且它能够通过在催化剂的存在下与氢反应而以化学方法被转化为2- 丁醇(Nystrom等人，J.Am.Chem.Soc.,69:1198,1947)。2，3-丁二醇可被 用于丁烯和丁二烯(二者是重要的化工原料，目前由裂化石油获得)的化学合成中，并且2，3- 丁二醇的酯可被用作增塑剂(Voloch等人,“FermentationDerived2, 3-Butanediol,，，！Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press Ltd.,England，第 2 卷，第 3 节，第 933-947 页，1986)。可工程化微生物以表达用于生产例如2，3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和异丁醇的产物的生物合成途径。美国专利7，851，188公开了用于生产异丁醇的工程化重组微生物。美国专利申请公布20070259410和20070292927公开了用于生产2- 丁酮或2- 丁醇的工程化重组微生物。已知多个用于异丁醇和2-丁醇的生物合成的途径，它们全部从细胞的丙酮酸开始。丁二醇是2-丁醇途径中的中间体，所述途径在美国专利申请公布20070292927中公开。已经改变了酵母中的丙酮酸代谢以生产乳酸和甘油。美国专利申请公布20070031950公开了带有一种或多种丙酮酸脱羧酶或丙酮酸脱氢酶基因的破坏并且表达D-乳酸脱氢酶基因的酵母菌株，其被用于生产D-乳酸。Ishida等人(Biosc1.Biotech,and Biochem.，70:1148-1153，2006)描述了具有破坏的丙酮酸脱羧酶基因并表达乳酸脱氧酶的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。美国专利申请公布2005/0059136公开了没有丙酮酸脱水酶活性的葡萄糖耐受的不依赖C2碳源(GCSI)的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脱氢酶基因。Nevoigt等人(Yeast，12:1331-1337，1996)描述了在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中降低的丙酮酸脱羧酶和提高的NAD-依赖的甘油_3_磷酸脱氢酶对甘油产量的影响。工业发酵生产醇或其它化合物需要酵母细胞稳定生产丙酮酸生物合成途径的多核苷酸。此外还需要在重组宿主细胞如酵母中生产异丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮的改善方法。
技术实现思路
本文提供了具有一种或多种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。与不具有编码催化生物合成途径步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽的整合多核苷酸的宿主细胞相比，此类宿主细胞提供稳定和/或增加生物合成途径产物形成的方法，所述产物例如异丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮。本专利技术的一个方面涉及包含编码多肽的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化，所述多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。在另一方面，所述宿主细胞包含利用丙酮酸的生物合成途径和编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。在另一方面，所述多核苷酸是宿主细胞异源性的。本专利技术的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含异丁醇生物合成途径，其中所述途径包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，所述多肽由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码，并且其中所述途径包括由多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸的底物至产物的转化，所述多肽由质粒上的多核苷酸编码。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相t匕，所述异丁醇生产的滴度是提高的。本专利技术的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途径，其中所述途径包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，所述多肽由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码，并且其中所述途径包括至少一种由多肽催化的底物至产物的转化，所述多肽由质粒上的多核苷酸编码。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生产的滴度是提高的。在另一方面，本专利技术涉及重组宿主细胞，其包含编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；和编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到宿主细胞的染色体中；并且其中所述第一、第二、和第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的不同步骤。 在另一方面，本专利技术涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化；(b)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和(c)编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化不是(a)或(b)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。在另一方面，本专利技术涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化α -酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和6)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化不是(a)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第二异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。在本专利技术的多个方面，所述宿主细胞是细菌、蓝细菌、丝状真菌或酵母。在另一方面，宿主细胞是下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、伊萨酵母属(Issatchenkia本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.07 US 61/380,563;2011.03.23 US 61/466,5571.重组宿主细胞，包含异丁醇生物合成途径，其中所述途径包括由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，并且其中所述途径包括由质粒上的多核苷酸编码的多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸的底物至产物的转化，并且其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述异丁醇生产的滴度是提高的。2.重组宿主细胞，包含2，3-丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途径，其中所述途径包括由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，并且其中所述途径包括至少一种由质粒上的多核苷酸编码的多肽催化的底物至产物的转化。3.根据权利要求1或2所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自:细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。4.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus )、产喊杆菌属(Alcali genes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽抱杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和糖酵母属(Saccharomyces)。5.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。6.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多肽是在所述宿主细胞胞质溶胶中表达的。7.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。8.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。9.根据权利要求1或3至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α -酮异戊酸至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。10.根据权利要求1或2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α -酮异戊酸至异丁酰-CoA ;异丁酰-CoA至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。11.根据权利要求1或2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α-酮异戊酸至缬氨酸；缬氨酸至异丁胺；异丁胺至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。12.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；以及2，3- 丁二醇至2- 丁酮。13.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；2，3- 丁二醇至2- 丁酮；以及2- 丁酮至2- 丁醇。14.根据权利要求1至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化的多肽是乙酰乳酸合酶。15.根据权利要求14所述的重组宿主，其中所述乙酰乳酸合酶与选自SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少约80%的同一性。16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中丙酮酸脱羧酶的表达是降低的或基本上消除的。17.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。18.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到内源性多核苷酸中，所述多核苷酸编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。19.根据权利要求1至18中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶的表达是降低的或基本上消除的。20.根据权利要求1至19中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中Fra2的表达是降低的或基本上消除的。21.根据权利要求1至20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到染色体中roc1-TRXI基因间区域处。22.重组宿主细胞，包含:(a)编码多肽的多核...

【专利技术属性】
技术研发人员：LC安东尼，LA马吉奥霍尔，BJ保罗，
申请(专利权)人：布特马斯先进生物燃料有限责任公司，
类型：
国别省市：