一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌及其构建方法与应用，该菌株分类命名为paenibacillus?polymyxa?CGMCC?3044-Bud?A-。Bud?A为2,3-丁二醇脱氢酶基因，通过同源双交换，敲除P.polymyxa?CGMCC?3044中的Bud?A基因获得菌株p.polymyxa?CGMCC?3044-Bud?A-。通过上述方法构建的重组菌能发酵合成光学纯S-3-羟基丁酮，光学纯度可达100%，无3-羟基丁酮还原态副产物2,3-丁二醇，该菌株能直接利用菊芋菊粉、葡萄糖、丁二酮等底物，培养条件粗放，操作方便简单，光学纯度高，生产成本低，有利于大规模产业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种产基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
3-羟基丁酮又名甲基乙酰甲醇、乙偶姻，可作为一种平台化合物，广泛应用于日化食品、制药、涂料、液晶材料等众多领域。2004年，美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一。3-羟基丁酮存在2个旋光异构体，分别为R型和S型3-羟基丁酮，S-3-羟基丁酮可用于合成4-氯-4，5- 二甲基-1，3 二氧杂环戊烷-2-酮(CDMDO)，CDMDO是合成青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物重要的医药中间体；S-3-羟基丁酮还可以用于合成抗菌药伦氨苄西林盐酸盐的中间体一4-溴甲基5-甲基-1，3-二氧戊环-2-酮。近年来，随着人们对S-3-羟基丁酮需求的不断增长，有关S-3-羟基丁酮的生产方法及应用研究已引起人们的广泛关注。目前S-3-羟基丁酮的合成方法主要有两种一是化学合成法，二是生物合成法。化学合成法存在反应步骤多，还需手性拆分，工艺繁琐，导致成本高、收率底，环境污染比较严重，且原料大都是不可再生的化石资源一石油，原料来源受到限制。生物合成法包括酶法和微生物发酵法，酶法是以丁二酮或丁二醇为原料，在酶的催化特异性作用下生产S-3-羟基丁酮，该方法转化率和光学纯度均能达到100%，但是和化学法一样原料来源受到限制，且产量偏低，难以大批量制备S-3-羟基丁酮。目前用于3-羟基丁酮生产及研究的菌株主要有克雷伯氏菌属(Klebisella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)以及沙雷氏菌属(Serratia)等，但是尚未发现用于生产光学纯S_3_羟基丁酮的野生菌株。目前文献报道的利用基因工程手段构建质粒转化大肠杆菌得到重组菌生产S-3-羟基丁酮，研究者将Bacillus subtilis 168中的2，3-丁二醇脱氧酶基因(Bud A)导入大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)中，构建重组菌E. coli BL21-Bud A，并以meso-2，3-丁二醇为底物利用该重组菌转化制备S-3-羟基丁酮，虽然获得成功，产量在36. 7g/L左右，但是该方法依然存在底物meso-2，3-丁二醇价格昂贵且难以获得，并存在重组质粒不稳定的问题，产量低，成本高等缺陷。(Xiao Zijun, Plos 0ne5 (2010,1) 1-6)
技术实现思路
专利技术目的为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供上述产S-3-羟基丁酮基因工程菌的构建方法。本专利技术还最后要解决的技术问题是提供上述产S-3-羟基丁酮基因工程菌的应用。技术方案为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一种产S-3-轻基丁酮基因工程菌，其分类命名为paenibacillus polymyxaCGMCC 3044-Bud A_，该工程菌是通过下列方法构建得到的利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 中扩增出 2，3_ 丁二醇脱氧酶基因 Bud A,5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带ARed同源重组序列克隆粘粒SuperCOs-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II,重组粘粒转化 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044,并在λ Red介导下与paenibacillus polymyxa CGMCC 3044发生同源双交换,得到重组的多粘类芽抱杆菌，即产S-3-轻基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-BudA'其中，SuperCos_l/pIJ790中 SuperCos-1 为粘粒；质粒 pIJ790 携带 λ Red 同源重组序列、oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK等序列。该基因工程菌通过下列方法构建得到(I)基因Bud A的克隆根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列设计合成PCR所需的引物Pl :5，-ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5， -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’以多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因组为模板完成PCR反应PCR 反应条件94° C 变性 5min，经 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 个循环，再经过72° C延伸lOmin，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PMD18-T载体连接,进行序列测定`,获得来源于多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044 的 2，3- 丁二醇脱氢酶基因(Bud A)；(2)重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂 II”的构建在Bud A的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I ;在Bud A的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I，BamH I，得到Bud A同源臂II;根据所述酶切位点连接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II ；(3)重组基因工程菌的获得将重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790-Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 转化多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽抱杆菌，命名为 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'其中该方法包括下列步骤利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044中扩增出2，3_ 丁二醇脱氢酶基因Bud A，5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带λ Red同源重组序列克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产S?3?羟基丁酮基因工程菌，其分类命名为paenibacillus?polymyxa?CGMCC?3044?Bud?A?，该工程菌是通过下列方法构建得到：利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌paenibacillus?polymyxa?CGMCC?3044中扩增出2,3?丁二醇脱氢酶基因Bud?A，5’端39bp碱基序列构成同源臂Ⅰ，3’端20bp碱基序列构成同源臂Ⅱ，通过多克隆位点将同源臂Ⅰ和同源臂Ⅱ分别串联到携带λRed同源重组序列克隆粘粒SuperCos?1/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraR序列的两端，得到含“Bud?A同源臂Ⅰ?oriT?ApraR?Bud?A同源臂Ⅱ”序列的重组粘粒SuperCos?1/pIJ790?Bud?A同源臂Ⅰ?oriT?ApraR?Bud?A同源臂Ⅱ，重组粘粒转化paenibacillus?polymyxa?CGMCC?3044，并在λRed介导下与paenibacillus?polymyxa?CGMCC?3044发生同源双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产S?3?羟基丁酮基因工程菌paenibacillus?polymyxa?CGMCC?3044?Bud?A?。...

【技术特征摘要】
1.一种产S-3-轻基丁酮基因工程菌，其分类命名为paenibacillus poIymyxaCGMCC 3044-Bud A_，该工程菌是通过下列方法构建得到利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 中扩增出 2，3_ 丁二醇脱氧酶基因 Bud A,5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带ARed同源重组序列克隆粘粒SuperCOs-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II,重组粘粒转化 paenibacillus po lymyxa CGMCC 3044,并在λ Red介导下与paenibacillus polymyxa CGMCC 3044发生同源双交换,得到重组的多粘类芽抱杆菌，即产S-3-轻基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-BudA'2.根据权利要求1所述的产S-3-羟基丁酮基因工程菌，其特征在于该工程菌通过下列方法构建得到 (1)基因BudA的克隆根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列设计合成PCR所需的引物Pl :5’ -ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5’ -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’ 以多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因组为模板完成PCR反应PCR 反应条件94° C 变性 5min，经 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 个循环，再经过72° C延伸lOmin，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PMD18-T载体连接,进行序列测定,获得来源于多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044的2，3- 丁二醇脱氢酶基因，即Bud A基因； (2)重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790_BudA 同源臂1-oriT_ApraK-Bud A 同源臂II” 的构建在Bud A的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I;在Bud A的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I，BamH I，得至Ij Bud A同源臂II ；根据所述酶切位点连接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II； (3)重组基因工程菌的获得将重组粘粒“SuperCOS-l/pIJ790-BudA同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 转化多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽抱杆菌，命名为 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'3.权利要求1所述的产S-3-羟基丁酮基因工程菌的构建方法，其特征在于该方法包括下列步骤利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044中扩增出2，3-丁二醇脱氢酶基因Bud A，5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带XRed同源重组序列克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-Bud A同源臂II”序列的重组粘粒SuperCos_l/pIJ790,重组粘粒转化paenibacillus polymyxa C...

【专利技术属性】
技术研发人员：高健，徐虹，李莎，冯小海，薛锋，李凤伟，邵荣，
申请(专利权)人：盐城工学院，
类型：发明
国别省市：