一种构建基因工程FK506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株技术

本发明专利技术公开了一种构建基因工程FK506(他克莫司)高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株。基因组中整合有表达与FK506生物合成相关基因的倍增表达盒的受体菌株具有稳定高产FK506的能力，具体地，以位点特异性整合机制介导的基因重组方式，将FK506基因簇中与前体生物合成相关的内源基因倍增到链霉菌染色体上，定向改造FK506产生链霉菌，获得FK506高产菌株。本发明专利技术还公开了FK506高产菌株的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种构建基因工程FK506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株
本专利技术属于生物技术工程领域，具体地，涉及一种构建基因工程FK506(他克莫司)高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株。
技术介绍
FK506又名他克莫司(商品名普乐可复)，是一种具有免疫抑制活性的23元大环内酯类化合物，由日本藤泽制药公司于1981年从筑波链霉菌StreptomycestsukubaensisNo.9993的代谢产物中提取获得。自1994年由FDA批准使用以来广泛应用于临床，其作用机制是能够抑制多种细胞因子如白细胞介素-2、γ干扰素的产生，阻断T细胞活化，抑制细胞毒性T细胞的增殖和白细胞介素-2受体的表达，FK506抑制IL-2的活性是环孢素的10-100倍，因而FK506不但能作为肾脏移植手术后的免疫抑制剂，对于系统性红斑狼疮、特应性皮炎、哮喘等疾病也有较好的疗效。由于FK506是来源于链霉菌的结构复杂的次级代谢产物，体外化学合成的难度极大，目前生产主要依赖于微生物发酵。研究表明，FK506的基本生物合成途径如下：聚酮合成酶(PKS)首先识别来源于分支酸的起始单元4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸(DHCHC)，伴随不同延伸单元的识别和上载得到完整的聚酮长链，接由非核糖体依赖的聚肽合成酶(NRPS)引入来源于L-赖氨酸的L-哌啶甲酸形成聚酮骨架环，最后由相关的O-甲基转移酶和P450加氧酶完成后修饰步骤。在FK506基因簇中，与前体烯丙基丙二酰-CoA、甲氧基丙二酰-ACP、4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸，以及L-哌啶甲酸合成相关的基因已经确证功能。基于FK506广泛的药理活性和临床应用，以提高FK506产量为目的的生产菌的遗传改造从未停止，过去的研究主要集中在发酵工艺优化和以传统的化学或物理诱变、自然选择等方法为主的遗传育种方面。然而这些方法改造的菌株存在遗产不稳定，难于保藏，且产量仍然较低等问题，因此本领域迫切需要开发构建基因工程FK506高产菌的方法，以满足临床需求。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种构建基因工程FK506(他克莫司)高产菌株的方法及其应用。本专利技术的另一目的是提供FK506(他克莫司)高产链霉菌及其用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种稳定高产FK506(他克莫司)的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有基因倍增表达盒，所述的基因倍增表达盒表达选自下组的基因所编码的蛋白：烯丙基丙二酰-CoA合成基因、甲氧基丙二酰-ACP合成基因、4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸合成基因，L-哌啶甲酸合成基因，或其组合。在另一优选例中，所述菌株包括链霉菌属。在另一优选例中，所述菌株为筑波链霉菌(Streptomycestsukubaensis)。在另一优选例中，所述的基因组中整合有1-20个所述的基因倍增表达盒。在另一优选例中，所述的基因组中整合有1-10个所述的基因倍增表达盒，较佳地为2个。在另一优选例中，所述基因倍增表达盒表达烯丙基丙二酰-CoA和/或甲氧基丙二酰-ACP合成基因编码的蛋白。在本专利技术的第二方面，提供了一种生产FK506(他克莫司)的方法，包括步骤：(i)培养本专利技术第一方面所述的工程菌株，从而获得含FK506(他克莫司)的发酵产物；和(ii)从所述发酵产物中分离出FK506(他克莫司)。在本专利技术的第三方面，提供了一种构建本专利技术第一方面所述菌株的方法，包括步骤：(a)构建含有基因倍增表达盒的载体，所述表达盒具有以下元件：ΦC31整合酶基因，噬菌体附着位点靶序列attP，属间接合元件oriT，阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV，和目的倍增基因；(b)将步骤(a)获得的含有基因倍增表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合有基因倍增表达盒的菌株。在另一优选例中，所述的构建本专利技术第一方面菌株的方法，还包括步骤(c)：PCR验证步骤(b)得到的整合有基因倍增表达盒的菌株的基因型；和/或步骤(d)：发酵检测得到的整合有基因倍增表达盒菌株的FK506(他克莫司)的产量。在另一优选例中，步骤(a)所述的倍增基因选自下组：烯丙基丙二酰-CoA合成基因、甲氧基丙二酰-ACP合成基因、4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸合成基因，L-哌啶甲酸合成基因，或其组合。在另一优选例中，步骤(a)所述的载体为质粒、黏粒或核酸片段。在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒含有强启动子元件。在另一优选例中，所述的强启动子元件为红霉素抗性基因ermE的启动子ermE*。在另一优选例中，步骤(a)所述的载体还包括抗性基因元件，较佳地为阿泊拉霉素抗性基因。在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒具有以下元件：强启动子元件ermE*、倍增目的基因tcsABCD、ΦC31整合酶基因、噬菌体附着位点靶序列attP、属间接合元件oriT，和阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒具有以下元件：强启动子元件ermE*、倍增目的基因fkbGKJIH、ΦC31整合酶基因、噬菌体附着位点靶序列attP、属间接合元件oriT，和阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。在另一优选例中，步骤(b)所述受体基因组整合的基因倍增表达盒数量为1-5个，较佳地为2个。在另一优选例中，步骤(b)所述的受体菌株具有附着位点attB。在另一优选例中，步骤(b)所述的整合为载体attP位点和受体基因组attB位点之间的位点特异性整合。在另一优选例中，attP位点和attB位点之间整合后形成重组杂合位点attL和attR。在另一优选例中，attL的核心核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，attR的核心核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。在另一优选例中，attL的核心核苷酸序列与SEQIDNO：1序列的同源性为70-100％，attR的核心核苷酸序列与SEQIDNO：2序列的同源性为70-100％。在本专利技术的第四方面，提供了一种本专利技术第一方面所述工程菌株的用途，它被用作发酵生产FK506(他克莫司)及其衍生物的工程菌。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1表示FK506和生物合成前体的化学结构。图1A显示FK506的化学结构。图1B为FK506的生物合成前体4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸。图1C为FK506的生物合成前体L-哌啶甲酸。图1D为FK506的生物合成前体丙二酰-CoA。图1E为FK506的生物合成前体甲基丙二酰-CoA。图1F为FK506的生物合成前体烯丙基丙二酰-CoA。图1G为FK506的生物合成前体甲氧基丙二酰-ACP。图2显示本专利技术由ΦC31整合酶介导的位点特异性重组过程：细菌附着位点attB在靶细胞的染色体上，噬菌体附着位点attP在供体质粒上，向靶细胞和供体分子引入ΦC31整合酶，从而形成由ΦC31整合酶介导的重组产物。图3显示了一种用于构建基因文库的质粒pSET152的结构：该质粒包含ΦC31整合酶基因序列、噬菌体附着位点attP序列、阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV、属间接合转移元件oriT。图4显示由pSET152和pOJ446构建的黏粒pJTU2554的结构：该质粒包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定高产FK506(他克莫司)的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有基因倍增表达盒，所述的基因倍增表达盒表达选自下组的基因所编码的蛋白：烯丙基丙二酰?CoA合成基因、甲氧基丙二酰?ACP合成基因、4，5?二羟基?1?环己烯基羧酸合成基因，L?哌啶甲酸合成基因，或其组合。

【技术特征摘要】
1.一种稳定高产FK506即他克莫司的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有基因倍增表达盒，所述的基因倍增表达盒表达烯丙基丙二酰-CoA合成基因所编码的蛋白，其中所述的基因倍增表达盒中含有的倍增目的基因为tcsABCD；并且，所述菌株为筑波链霉菌Streptomycestsukubaensis。2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有1-20个所述的基因倍增表达盒。3.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的基因组中整合有1-10个所述的基因倍增表达盒。4.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述的基因组中整合有2个所述的基因倍增表达盒。5.如权利要求1-4中任一所述的工程菌株，其特征在于，所述基因倍增表达盒还表达甲氧基丙二酰-ACP合成基因编码的蛋白，其中所述的甲氧基丙二酰-ACP合成基因为fkbGKJIH。6.一种生产FK506即他克莫司的方法，其特征在于，包括步骤：(i)培养权利要求1所述的工程菌株，从而获得含FK506的发酵产物；和(ii)从所述发酵产物中分离出FK506。7.一种构建权利要求1所述菌株的方法，其特征在于，包括步骤：(a)构建含有基因倍增表达盒的载体，所述表达盒具有以下元件：ΦC31整合酶基因，噬菌体附着位点靶序列attP，属间接合元件oriT，阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV，和倍增目的基因，其中所述倍增目的基因为tcsABCD；(b)将步骤(a)获得的含有基因倍增表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合有基因倍增表达盒的菌株。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括步骤(c)：PCR验证步骤(b)得到的整合有基因倍增表达盒的菌株的基因型；和/或步骤(d)：发酵检测得到的整合有...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文，徐志南，陈丹丹，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，浙江大学，
类型：发明
国别省市：