生产DL-丙氨酸的工程菌及利用该工程菌生产DL-丙氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产DL-丙氨酸的工程菌。该生产DL-丙氨酸工程菌自身的乳酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、乙醇脱氢酶、乙酸激酶、富马酸还原酶、丙氨酸消旋酶、甲基乙二醛合成酶均被失活；且其染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因和丙氨酸消旋酶基因。本申请中，通过在工程菌染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因，从而将糖酵解的中间物丙酮酸转化为L-丙氨酸；再进一步的整合外源丙氨酸消旋酶基因，将部分L-丙氨酸转化为D-丙氨酸。从而实现由糖原料一步生产DL-丙氨酸，减小DL-丙氨酸的生产周期，且可提高DL-丙氨酸的产率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DL-丙氨酸生产领域，具体涉及一种生产DL-丙氨酸及利用该工程菌生产DL-丙氨酸的方法。
技术介绍
DL-丙氨酸主要用于食品加工业，用作营养增补剂及调味料，具有良好的鲜味，可以增强调味料的调味效果。其次用于医药工业，用于合成一些农药、医药和医药中间体。目前，DL-丙氨酸的生产主要是通过酶催化技术(丙氨酸消旋酶)或化学消旋法来生产，而化学消旋法因需要以有机酸为溶剂，存在着污染环境和收率偏低等缺点，因此逐渐被淘汰。酶催化技术是先将葡萄糖发酵生成L-丙氨酸，再将L-丙氨酸通过酶催化转化成D-丙氨酸，在该方案中，DL-丙氨酸积累量为30 50g/L，产率偏低，且生产周期长；其次，需要对菌株进行高密度培养以分泌生产DL-丙氨酸所需的丙氨酸消旋酶，该过程对氧气的需求量大；另外，由于丙氨酸消旋酶基因是克隆在质粒上进行高表达的，因此在菌株培养过程中，需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传复制。因此该方案也不易实现工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种生产DL-丙氨酸的工程菌，该工程菌可利用葡萄糖直接生产DL-丙氨酸，且生产周期短、DL-丙氨酸的产率高。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案该生产DL-丙氨酸的工程菌，是将出发细菌染色体上的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因、 丙氨酸消旋酶基因、甲基乙二醛合成酶基因灭活；且其染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因和外源的丙氨酸消旋酶基因，筛选得到生产DL-丙氨酸的工程菌。所述灭活的方法为敲除、插入突变、或利用小RNA干扰所述基因的表达。由于细菌在代谢过程中进行L-丙氨酸合成代谢，因此上述限定的方案可在常用所有细菌中实现，本身申请中优选选用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(统称大肠杆菌)作为生产DL-丙氨酸的工程菌的构建细菌。所述外源的L-丙氨酸脱氢酶基因来自于嗜热脂肪地芽孢杆菌；所述外源的丙氨酸消旋酶基因来自于枯草芽孢杆菌，优选来源于枯草芽孢杆菌168 ;丙氨酸消旋酶的失活主要是指大肠杆菌自身的丙氨酸消旋酶(DadX)基因被敲除。上述构建方案中直接将alaR基因整合到生产L-丙氨酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A26 菌株(CN 102329765A)内。XZ-A26 菌株于 2010 年 7 月 26 日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No. 4036。XZ-A26菌株中的乳酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、乙醇脱氢酶、乙酸激酶、富马酸还原酶、丙氨酸消旋酶均已被失活且其染色体上已经整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因，因此只需要在XZ-A26菌株染色体上整合外源丙氨酸消旋酶基因，并敲除甲基乙二醛合成酶基因即可。若用原始的细菌构建本专利技术中生产DL-丙氨酸工程菌，可采用敲除细菌自身染色体上的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因、丙氨酸消旋酶基因、甲基乙二醛合成酶基因，并整合外源的L-丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶基因来达到相同效果，敲除和整合上述基因的方法可按照名称为“一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株及构建方法与应用”(CN 102329765A)的中国专利文件中所记载的技术方案进行实施。本专利技术生产DL-丙氨酸工程菌的构建方法具体包括以大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)XZ-A26CGMCC No. 4036为出发菌株，并将外源的丙氨酸消旋酶基因整合在该菌株染色体上的甲基乙二醛合成酶基因位点。所述外源的丙氨酸消旋酶基因的序列为序列表中序列14，所述甲基乙二醛合成酶基因的序列为自序列表中序列15的5'端第495-953位核苷酸；所述人工调控元件M1-93的序列为序列表中序列17。本专利技术生产DL-丙氨酸的工程菌是通过以下操作步骤构建得到；(a)丙氨酸消旋酶基因的克隆和整合I)构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游臂、氯霉素基因、果聚糖蔗糖转移酶基因和甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游臂组成的DNA片段I，将DNA片段I电激转化带有PKD46质粒的大肠埃希氏菌XZ-A26CGMCC No. 4036，筛选氯霉素抗性的菌落，并用序列为SEQ ID NO 3的DNA片段和序列SEQ ID NO 4的DNA片段组成的引物对鉴定，获得扩增产物为411 Ibp的菌株，命名为XZ-A27 ；2)构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游臂、IacI基因、trc启动子、枯草芽孢杆菌168的丙氨 酸消旋酶基因alaR和甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游臂组成的DNA片段II ;将DNA片段II电激转化带有pKD46质粒的XZ-A27，用含有蔗糖不含氯化钠的LB培养基培养，并筛选用序列为SEQ ID NO 3的DNA片段和序列SEQID NO 4的DNA片段组成的引物对鉴定扩增产物为4210bp的菌株；命名为XZ-A28 ；(b)丙氨酸消旋酶基因alaR的调控3)构建DNA片段III ;DNA片段III电激转化带有pKD46质粒的XZ-A28，用序列为SEQ ID NO 11的DNA片段和序列SEQ ID NO 13的DNA片段组成的引物对鉴定，获得扩增产物为1890bp的菌株，即为生产DL-丙氨酸的工程菌；其中，更具体的，DNA片段I的获得方法如下所示将以大肠杆菌ATCC 8739的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的引物对为引物扩增得到的甲基乙二醛合成酶基因mgsA及其上下游片段，将扩增得到的产物克隆至pEASY-Blunt克隆载体上，获得卡那霉素抗性质粒PXZ-A19 ;用SEQ ID NO 5和SEQ IDNO 6所示的DNA片段为引物以PXZ-A19为模板扩增的产物与含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的DNA片段连接得到质粒PXZ-A20，用SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的DNA片段为引物，以pXZ_A20质粒DNA为模板，扩增出DNA片段I ;其中，含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的DNA片段的获得方法是以PL0I4162质粒为模板，以SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示的引物对为引物扩增得到的DNA片段；DNA片段II的获得方法如下所示以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，以SEQID NO :1和SEQ ID NO 2为引物扩增得到的丙氨酸消旋酶基因片段插入到pTrc99A质粒的XbaI和SalI酶切位点之间，获得质粒pTrc99A_alaR ;用SEQ ID NO 5和SEQID NO 6所示的DNA片段为引物以pXZ-A19为模板扩增的产物与以SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10所示引物以pTrc99A-alaR为模板扩增的产物连接得到质粒pXZ-A21，用SEQ ID NO :3和SEQ IDNO 4所示的DNA片段为引物，以pXZ-A21质粒DNA为模板，扩增出DNA片段II ；DNA片段III的获得方法如下所示以重组大肠杆菌菌株M1-93的基因组DNA为模板，以序列如SEQ ID NO:1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产DL?丙氨酸的工程菌，其特征在于：是将出发细菌染色体上的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因、丙氨酸消旋酶基因和甲基乙二醛合成酶基因灭活；且其染色体上整合了外源的L?丙氨酸脱氢酶基因和外源的丙氨酸消旋酶基因，筛选得到生产DL?丙氨酸的工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种生产DL-丙氨酸的工程菌，其特征在于是将出发细菌染色体上的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因、丙氨酸消旋酶基因和甲基乙二醛合成酶基因灭活；且其染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因和外源的丙氨酸消旋酶基因，筛选得到生产DL-丙氨酸的工程菌。2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述出发细菌为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli);所述灭活的方法为敲除、插入突变、或利用小RNA干扰所述基因的表达。3.如权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于所述外源的L-丙氨酸脱氢酶基因来自于嗜热脂肪地芽孢杆菌；所述外源的丙氨酸消旋酶基因来自于枯草芽孢杆菌，优选来源于枯草芽孢杆菌168。4.如权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于生产DL-丙氨酸工程菌的构建方法包括以大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A26CGMCC No. 4036为出发菌株，将外源的丙氨酸消旋酶基因整合在该菌株染色体的甲基乙二醛合成酶基因位点，并用人工调控元件 M1-93对外源的丙氨酸消旋酶基因的表达进行调控；所述外源的丙氨酸消旋酶基因的序列为序列表中序列14，所述甲基乙二醛合成酶基因的序列为自序列表中序列15的5'端第 495-953位核苷酸；所述人工调控元件M1-93的序列为序列表中序列17。5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于该生产DL-丙氨酸的工程菌是通过以下操作步骤构建得到；1)构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游片段、氯霉素基因、果聚糖蔗糖转移酶基因和甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游片段组成的DNA片段I，将DNA片段I电激转化带有PKD46质粒的大肠埃希氏菌XZ-A26CGMCC No. 4036，筛选氯霉素抗性的菌落， 并用序列为SEQ ID NO :3的DNA片段和序列SEQ ID NO 4的DNA片段组成的引物对鉴定， 获得扩增产物为4111bp的菌株，命名为XZ-A27 ;DNA片段I的获得方法如下所示将以大肠杆菌ATCC 8739的基因组基因为模板，以SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的引物对为引物扩增得到的甲基乙二醛合成酶基因mgsA及其上下游片段，将扩增得到的产物克隆至 pEASY-Blunt克隆载体上，获得卡那霉素抗性质粒pXZ_A19 ;用SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 6所示的DNA片段为引物以PXZ-A19为模板扩增的产物与含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的DNA片段连接得到质粒pXZ-A20，用SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的DNA 片段为引物，以PXZ-A20质粒DNA为模板，扩增出DNA片段I ;其中，含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的DNA片段的获得方法是以pL0I4162为模板，以SEQ ID NO :7和SEQ ID NO 8所示的引物对为引物扩增得到的DNA片段；2)构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游臂、IacI基因、trc启动子、枯草芽孢杆菌168的丙氨酸消旋酶基因和甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游臂组成的DNA片段 II JfDNA片段II电激转化带有pKD46质粒的XZ-A...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，张冬竹，
申请(专利权)人：安徽华恒生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：