本发明专利技术公开了一种利用共固定化酶合成d-丙氨酸的方法。包括以下步骤：meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体和FDH共固定化于载体上，以共固定化酶为生物催化剂，NAD（H）为辅酶，催化α-酮酸底物合成d-丙氨酸，反应结束后，将反应液直接滤除，共固定化酶回收重复使用，得到的反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到d-丙氨酸，产物d-丙氨酸的光学纯度>98%。该方法把两种酶共固定化于载体上，连续使用120批次，在填充柱中可连续催化反应55天，固定化酶活力没有明显下降，具有固定化方法简单易行，原料便宜，反应条件温和，酶活力回收较高，酶稳定性较高，成本低廉、后期提纯工艺简便等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化领域，涉及一种共固定化酶催化合成D-丙氨酸的方法。把meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体和FDH共固定化于载体上，共固定化酶为生物催化剂，以NAD（H）为辅酶，催化α-酮酸底物合成D-丙氨酸，反应结束后将反应液直接滤除，共固定化酶回收可重复使用120批，在填充柱中可连续催化反应55天，活性没有明显下降，得到的反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到D-丙氨酸。产物D-丙氨酸的光学纯度 >98%。
技术介绍
-丙氨酸是白色晶体，有特殊的结晶形状。有甜味，溶于水、强碱和强酸溶液，不溶于无水酒精，乙醚和丙酮。在2%的盐酸（5 mol/L）中25℃比旋光度是-14.6，在2%的水中25℃比旋光度是-1.8。D-丙氨酸是一种非天然氨基酸，是重要的手性药物中间体，用于生产新型广谱抗生素、D-丙氨醇、多肽合成过程的丙氨酸保护剂、食品添加剂、化妆品、维生素B6以及合成新型甜味剂阿力甜等[代书玲，徐虹，欧阳平凯，D-天冬氨酸的制备和应用［J］.南京工业大学学报，2003，25（3）:108-110.]。-丙氨酸的制备方法主要有微生物发酵法[Terasawa Masato，Nara shoichi.Manufacture of D2aspartic acid with aspartase［P］.JP：04008297，1992201213.]，化学合成法[Soda Kenji，Kageyama sadao.Manufacture of D -aspartic acid with malic acid dahydrogenase，alanine dahydrogenase，alanine racemase and D-amino acid transaminase［P］.JP:01285193，1989211216.]和生物酶催化合成法。其中，发酵法生产周期长、设备投资大、有副反应、分离较复杂、污染大；不对称化学合成法反应机制相当复杂，工艺过程长，需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂，环境污染大。生物催化合成法是通过酶进行催化或者拆分，用于合成D-氨基酸的酶如转氨酶[Eul-Soo Park, Joo-Young Dong and Jong-Shik Shin, ω-Transaminase-catalyzed asymmetric synthesis of unnatural amino acids using isopropylamine as an amino donor, Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 6929-6933]、meso-二氨基庚二酸脱氢酶（DAPDH）[Gao X., Chen X., Liu W., Feng J., Wu Q., Hua L., Zhu D., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 8595-8600，专利申请号：201210334554.6]以及目前国内外工业化生产D-丙氨酸普遍采用的氨基酸酰化酶［周秀琴.氨基酸代谢相关的酶［J］.发酵科技通讯，2006，35（1）:43-44.］等，酶催化方法存在酶的价格昂贵，同时游离酶对环境敏感、容易失活，且存在无法回收，反应成本高，二次污染等问题。固定化酶技术发展于 20 世纪 60 年代。与游离酶相比有很多优点，如：产物易分离；可以重复多批次使用；酶的稳定性提高；简化了后期提纯工艺等[罗贵民. 酶工程[M]. 北京：化学工业出版社，2002，2]；共固定化酶是将两种或两种以上的酶固定于同一载体内形成共固定化系统的一种技术[徐莉，侯红萍. 酶的固定化方法的研究进展[J]. 酿酒科技，2010(1)：86–90]。共固定化酶可以充分发挥不同酶的特点，将其催化特性结合起来，充分利用协同作用，提高其催化效率。同时可以减少反应时间和步骤，连续生产，能够更好的控制产品质量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种反应条件温和，酶活力回收较高，成本低廉、工艺简单的利用共固定化酶制备D-丙氨酸的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是，一种利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法，具体包括以下步骤：（1）将一定比例的meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体酶液和甲酸脱氢酶酶液混合，加入环氧基树脂或者活化后的氨基树脂，室温下搅拌15-30小时，取出载体，用缓冲液洗至无游离蛋白，将载体加入到一定浓度的封闭剂溶液中25°C搅拌6-10小时，取出载体后将其用缓冲液洗三遍。得到的共固定化酶4°C保存备用。（2）α-酮酸、α-酮酸盐和氨基化合物作为底物与溶剂构成的反应体系中加入共固定化酶和少量辅酶进行催化还原胺化反应，反应温度20~60 °C，反应pH值为6~11，反应时间4~72小时，制得光学纯度>98% D-氨基酸。（3）将反应液直接滤除，共固定化酶回收重复使用，得到的反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到D-丙氨酸。所述步骤（1）中meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，可通过以下步骤获得：a． 以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35E单位点突变；b． 以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35E/R36V两位点组合突变；c． 以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36V两位点组合突变；d． 以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36Q两位点组合突变；e． 以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36Q/Y76V三位点组合突变；f． 将构建的突变子工程菌进行培养、并对目的蛋白进行诱导表达；g． 将步骤f中的单位点、双位点、三位点组合突变体分别收集菌体后，用缓冲液进行重悬，进行高压破碎，离心取破碎上清，通过Ni-NTA层析柱纯化；h． 将步骤f中三位点组合突变体收集菌体后，用缓冲液进行重悬，进行高压破碎，离心取破碎上清。将破碎上清于70℃水浴中热处理30 min，再次离心取热处理上清。所述步骤（1）中载体为表面含有氨基或者环氧基官能团的载体，如：ES-1，ES-101，ES-102，ES-103，ESR-1，ESR-2, ESR-3, ESQ-1（购自天津南开和成科技有限公司），优选表面含有氨基的树脂为固定化载体。所述步骤（1）中共固定酶meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体酶液和甲酸脱氢酶两种酶的酶量比例在1:1-1:5之间，优选比例为1:3。所选封闭剂包括盐酸乙二胺、二乙胺和α-甲基苄胺，乙醇胺等，封闭剂浓度在0.1mmol/g载体-3mmol/g载体，优选封闭剂为乙醇胺，浓度为0.1mmol/g载体-1mmol/g载体。所述步骤（2）中，α-酮酸、α-酮酸盐和氨基化合物作为底物与溶剂构成的反应体系中加入共固定化酶和少本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用共固定化酶合成d‑丙氨酸的方法，其特点在于，包括以下步骤：（1）将一定比例的meso‑二氨基庚二酸脱氢酶突变体酶液和甲酸脱氢酶酶液混 合，加入环氧基树脂或者活化后的氨基树脂，室温下搅拌15‑30小时，取出载体，用缓冲液洗至无游离蛋白，将载体加入到一定浓度的封闭剂溶液中25°C搅拌6‑10小时，取出载体后将其用缓冲液洗三遍,4°C保存备用；（2）α‑酮酸、α‑酮酸盐和氨基化合物作为底物与溶剂构成的反应体系中加入共固定化酶和少量辅酶进行催化还原胺化反应，反应温度20~60 °C，反应pH值为6~11，反应时间4~72小时，制得光学纯度>98% d‑氨基酸；（3）将反应液直接滤除，共固定化酶回收重复使用，得到的反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到d‑丙氨酸。
【技术特征摘要】
1.一种利用共固定化酶合成d-丙氨酸的方法，其特点在于，包括以下步骤：（1）将一定比例的meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体酶液和甲酸脱氢酶酶液混 合，加入环氧基树脂或者活化后的氨基树脂，室温下搅拌15-30小时，取出载体，用缓冲液洗至无游离蛋白，将载体加入到一定浓度的封闭剂溶液中25°C搅拌6-10小时，取出载体后将其用缓冲液洗三遍,4°C保存备用；（2）α-酮酸、α-酮酸盐和氨基化合物作为底物与溶剂构成的反应体系中加入共固定化酶和少量辅酶进行催化还原胺化反应，反应温度20~60 °C，反应pH值为6~11，反应时间4~72小时，制得光学纯度>98% d-氨基酸；（3）将反应液直接滤除，共固定化酶回收重复使用，得到的反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到d-丙氨酸。2.如权利要求1一种利用共固定化酶合成d-丙氨酸的方法，其特征在于，来源于嗜热共生杆菌（Symbiobacterium thermophilum）meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的突变位点为第35位精氨酸（R）替换为谷氨酸（E），即R35E。3.如权利要求1一种利用共固定化酶合成d-丙氨酸的方法，其特征在于，来源于嗜热共生杆菌（Symbiobacterium thermophilum）meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的第35位精氨酸（R）替换为谷氨酸（E）；将第36位精氨酸（R）替换为缬氨酸（V），即R35E/R36V。4.如权利要求1一种利用共固定化酶合成d-丙氨酸的方法，其特征在于，来源于嗜热共生杆菌（Symbiobacterium thermophilum）meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的第35位精氨酸（R）替换为天冬氨酸(D)；将第36位精氨酸（R）...
【专利技术属性】
技术研发人员：李键煚，陈曦，崔云凤，刘卫东，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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