一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶技术

本发明专利技术提出一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶，属于生物工程领域，能够获得高催化效率、低成本的固定化多酶。该双酶共固定化方法包括向含有待固定化的α‑乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化钙溶液，在设定温度下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。本发明专利技术能够应用于啤酒生产中，尤其是应用在啤酒生产过程中的清酒的最后过滤阶段中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种酶的固定化方法，尤其涉及一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶。
技术介绍
酶制剂作为生物工程研究的硕果之一，在啤酒行业得到了普及。通过使用酶制剂，可以弥补麦芽中酶活力的不足，改善麦汁成分，提高啤酒发酵度，缩短发酵周期，增加产量等。在生产过程中补充外加酶，始终贯穿于啤酒生产的全过程之中，它可使操作简便，效益提高。如发酵液中添加脯氨酸内切酶，可以增强啤酒的非生物稳定性；向发酵液中添加α-乙酰乳酸脱羧酶，可以方便快捷的降低双乙酰含量等。酶制剂一般是以液态形式加入到糖化或发酵罐等罐体中，这种外源酶一旦加入就难以分离并再利用，由于酶制剂价格一般比较高，单次利用对成本不利。另外，添加到发酵罐内的酶制剂不会经过蒸煮过程变性析出，一般在成品酒经巴氏灭菌后仍存在一定的酶活力，在啤酒存放过程中，会受到残余酶的作用，使得啤酒口味会变甜、寡淡。酶制剂的这些限制因素导致了其应用受到一定影响。将酶细胞固定化是改善上述酶制剂问题有效手段之一。固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，克服了游离酶的上述不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点，因此酶或细胞的固定化受到研究者日益重视。随着科技不断发展，人们根据传统酶固定化技术存在的问题，不断探索改进、完善和发展新的酶固定化方法。过去几十年里，固定化酶技术的研究主要集中在单酶固定化。近年来，多酶共固定化由于具有可增加反应的局部浓度、提高反应收率等优点而得到研究者的广泛关注。固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使酶催化反应速率大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行，因此将会在工业生产中发挥巨大的作用。但目前由于固定化多酶成本较高，在工业上的应用还很少，因此如何提供一种多酶的固定化方法，以获得高催化效率、低成本的固定化多酶，将是本领域所研究的重要课题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶，能够获得高催化效率、低成本的固定化多酶。为了达到上述目的，本专利技术的一方面提供了一种双酶共固定化方法，向含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化钙溶液，在设定温度下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。作为优选技术方案，所述固定化酶的结构为α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶，其中磷酸钙为载体，每毫克载磷酸钙可固定化酶的含量为0.92-47.68mg。作为优选技术方案，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为4mmol/L，在所述磷酸盐缓冲溶液中，α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度为0.1-4.8mg/ml，优选为2.4mg/ml。作为可选技术方案，所述氯化钙溶液的浓度为0.1-0.5mol/L，优选为0.1-0.3mol/L，进一步优选为0.2mol/L。作为可选技术方案，所述缓冲溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:1-200:1，优选为30:1-80:1，进一步优选为50:1。作为可选技术方案，所述设定温度为0-60℃，优选为0-40℃；反应时间为1-24小时，优选为4-18小时，进一步优选为12小时。本专利技术的另一方面提供了一种如上述任一项技术方案所述的双酶共固定化方法制备得到的固定化酶。本专利技术的再一方面提供了一种如上述技术方案所述的固定化酶在啤酒生产过程中的应用。作为可选技术方案，所述固定化酶在啤酒生产过程中的清酒的最后过滤阶段添加。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：1、由本专利技术实施例提供的共固定化方法制备得到的固定化酶可大大拓宽了双酶在同时工作时对pH以及温度的耐受性，从而有利于满足后续工序的操作条件；2、α-乙酰乳酸脱羧酶的底物为α-乙酰乳酸，产物为乙偶姻，而脯氨酸内切酶作用于富含脯氨酸片段的特殊多肽，产物为多肽水解后的小肽，因此两种酶各自的底物和产物均不会对彼此的酶活性产生影响，从而有利于提高固定化酶的催化效率；3、在同一载体上同时固定两种酶可节约固定化酶的生产成本以及使用过程中的操作成本。附图说明图1为本专利技术对比例所提供的固定化酶在总酶浓度为0mg/ml时的电镜照片；图2为本专利技术实施例所提供的固定化酶在总酶浓度为0.1mg/ml时的电镜照片；图3为本专利技术实施例所提供的固定化酶在总酶浓度为2.4mg/ml时的电镜照片；图4为本专利技术实施例所提供的固定化酶在总酶浓度为4.8mg/ml时的电镜照片。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术一方面的实施例提供了一种双酶共固定化方法，向含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化钙溶液，在设定温度下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。在一优选实施例中，所述固定化酶的结构为α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶，其中磷酸钙为载体，每毫克载磷酸钙可固定化酶的含量为0.92-47.68mg。在本实施例中，所得到的固定化酶为α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶中，磷酸钙由上述方法中的氯化钙反应得到。在一优选实施例中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为4mmol/L，在所述磷酸盐缓冲溶液中，α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度为0.1-4.8mg/ml，优选为2.4mg/ml。在本实施例中，具体限定了磷酸盐缓冲溶液的浓度以及α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度，这主要是因为如果酶的总浓度或缓冲溶液的浓度太大或太小，均会导致生成的固定化酶的结构不具备纳米花结构，进而导致比表面积变小，催化活性变低。可以理解的是，本领域技术人员可根据实际情况在上述范围内进行合理选择，例如α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度还可以为0.6mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2.4mg/ml、3.0mg/ml、3.6mg/ml、4.2mg/ml、4.8mg/ml，当然也可以为上述范围内的其它任一值。在一可选实施例中，所述氯化钙溶液的浓度为0.1-0.5mol/L，优选为0.1-0.3mol/L，进一步优选为0.2mol/L。在本实施例中，限定了氯化钙溶液的浓度，这主要是考虑到氯化钙浓度的偏低或过高也均会最终得到的固定化酶产生影响，例如偏低则无沉淀产生，过高则影响固定化酶的纳米结构，从而导致比表面积变小，催化活性变低。可以理解的是，本领域技术人员可根据实际情况在上述范围内进行合理选择，例如，氯化钙溶液的浓度还可以为0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、0.35mol/L、0.4mol/L、0.45mol/L、0.5mol/L，当然也可以为上述范围内的其它任一值。在一可选实施例中，所述缓冲溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:1-200:1，优选为30:1-80:1，进一步优选为50:1。在本实施例中，进一步限定了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双酶共固定化方法，其特征在于，向含有待固定化的α‑乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化钙溶液，在设定温度下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。

【技术特征摘要】
1.一种双酶共固定化方法，其特征在于，向含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的缓冲溶液中加入氯化钙溶液，在设定温度下充分反应，离心分离，洗涤，得到形成具有纳米花结构的固定化酶。2.根据权利要求1所述的双酶共固定化方法，其特征在于，所述固定化酶的结构为α-乙酰乳酸脱羧酶-磷酸钙-脯氨酸内切酶，其中磷酸钙为载体，每毫克载磷酸钙可固定化酶的含量为0.92-47.68mg。3.根据权利要求1或2所述的双酶共固定化方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为4mmol/L，在所述磷酸盐缓冲溶液中，α-乙酰乳酸脱羧酶和脯氨酸内切酶的总浓度为0.1-4.8mg/ml，优选为2.4mg/ml。4.根据权利要求1或2所述的双酶共固定化方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：董建军，侯同刚，余俊红，王建勋，尹花，王乔，常宗明，黄淑霞，咸漠，胡淑敏，
申请(专利权)人：青岛啤酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37