本发明专利技术公开了一种固定过氧化氢酶的明胶‑二氧化硅杂化微球的方法。该方法以微孔膜渗透乳化过程为主加以实现的，其特征在于包括：制备含过氧化氢酶浓度为0.1‑2毫克/升的明胶/过氧化氢酶溶液；制备含有司班‑80质量浓度为0.25‑4.0%的液体石蜡油；将明胶/过氧化氢酶溶液与液体石蜡油混合制粗乳液；粗乳液以压力反复透过微孔膜，得到多级乳化的W/O型乳液；将多级乳化的W/O型乳液滴加入正硅酸乙酯水解液中，经过仿生矿化反应、固化、洗涤后得到用于固定化酶的明胶‑二氧化硅杂化微球。本发明专利技术的优点：制备条件温和，工艺简单易行，制得微球粒度均一，用于固定过氧化氢酶的能力强，耐受酸碱性好，储存稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球制备方法，属于固定化酶的杂化微球
技术介绍
明胶微球是一种常用的固定化酶载体，其优点在于包埋条件温和，生物相容性好，有利于维持酶的结构完整性，进而提高酶的活性维持率。明胶微球固定化酶通常存在的问题是载体的孔径较大，酶分子容易泄露。微球易溶胀，机械强度差，循环使用稳定性和储存稳定性不高。解决问题的方法通常是在明胶微球中填充无机组分、或者在明胶微球外表面构造无机壳层，制备有机-无机杂化微球，以提高微球的机械性能，同时抑制酶分子的泄露，提高酶对温度、pH变化的耐受性，同时提高储存和循环使用稳定性。二氧化硅是有机-无机杂化材料中常见的无机组分，可用于制备杂化微球。MaterialsScienceandEngineeringC62(2016)678–685公布了一种制备明胶-二氧化硅杂化微球的方法，其过程包括：将明胶溶解于乙醇/水混合体系中，并加入交联剂3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，得到明胶溶液；将正硅酸乙酯、氯化钙和磷酸三乙酯混合，得到硅前驱体溶液；将明胶溶液与硅前驱体溶液混合，并倒入植物油中进行搅拌乳化，得到w/o型乳液；将乳液在-70℃下冷冻固化成型，并依次利用乙醇和丙酮进行洗涤，得到明胶-二氧化硅杂化微球。此法所得的杂化微球的中位粒径D50值在124-276微米范围内。仿生硅化为二氧化硅材料的制备提供了一条新途径，仿生硅化避免了酸碱催化的使用，制备简单，所用原料均具有很好的生物相容性，适用范围广。ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces35(2004)53–58公布了一种制备明胶-二氧化硅杂化微球的方法，其过程包括：将明胶固体溶解于pH5.0的去离子水中，得到明胶质量分数0.5-30%的明胶溶液；将硅酸钠固体溶解于去离子水中，得到硅酸钠质量分数为0.1-1.0%的硅酸钠溶液；在37℃下将明胶溶液与硅酸钠溶液混合，搅拌1小时，在20℃水浴中静置一天，得到明胶-二氧化硅杂化微球。此法所得的杂化微球粒径在50-350纳米范围内。利用明胶仿生硅化过程制备明胶-二氧化硅杂化载体用于固定化酶具有良好的应用前景。专利技术专利CN201310425486.9公开了一种包埋醇脱氢酶的明胶-二氧化硅杂化凝胶及制备方法。该包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶，粒径为3-4mm，在明胶核上包覆有氧化硅壳层。其制备方法过程包括：配制明胶及含有醇脱氢酶混合溶液；配制硅酸钠及戊二醛溶液前驱体混合溶液；将明胶及醇脱氢酶的混合溶液逐滴加入到0~4℃的去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，再经搅拌孵化得到包埋醇脱氢酶的明胶-二氧化硅杂化凝胶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过将仿生矿化过程与膜乳化过程结合，提供一种以微孔膜渗透乳化制备固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球的方法。以该方法所制得的明胶-二氧化硅杂化微球粒度均一、大小可控，用于固定过氧化氢酶，过氧化氢酶的泄漏率低，且耐酸碱环境能力强，储存稳定性好。本专利技术是通过以下技术方案加以实现的，一种固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球的方法，该方法采用包括微孔膜组件的装置，以微孔膜渗透乳化过程为主加以实现的，其特征在于包括以下步骤：1）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将固体明胶溶解于去离子水中，配制成浓度为0.05-0.5克/毫升的明胶溶液，再向其中加入溶解过氧化氢酶，使过氧化氢酶浓度保持为0.1-2毫克/升，制得水相明胶/过氧化氢酶溶液；2）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将油溶性乳化剂司班-80加入到液体石蜡中，配制成含有司班-80质量浓度为0.25-4.0%的液体石蜡油，称为油相；3）按步骤1）制的水相明胶/过氧化氢酶溶液与步骤2）制的油相液体石蜡油的体积比为1:（2~15），在温度40℃-70℃及200-1200rpm速度下搅拌下，将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中，得到粗乳液；4）将步骤3）制的粗乳液加入装配有膜孔径为3.5-10.2微米的微孔膜的膜乳化装置内，以20kPa-50kPa压力使粗乳液通过微孔膜腔,进入收集器后，再回加入膜乳化器中，如此循环2-10次，得到多级乳化的W/O型乳液；5）以正硅酸乙酯与去离子水按摩尔比为1:（0.05-0.4）混合，并向该混合中，按催化剂盐酸与正硅酸乙酯摩尔比为（0.005-0.02）:1加入盐酸，然后在室温下超声振荡直至得到澄清透明的溶液，再用去离子水稀释溶液至浓度20-150mM，并且用NaOH将稀释溶液的pH值调至6.0-8.0，得到正硅酸乙酯水解液；6）在400rpm速度搅拌下，以步骤5）制得的正硅酸乙酯水解液与步骤4）制得的多级乳化W/O型乳液按体积比为1:（1.0-4.0），将多级乳化W/O型乳液加入正硅酸乙酯水解液中，加毕后在温度0℃-8℃冰水浴中，交联固化0.5-4小时后，再分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至去除油相为止，然后在空气中自然干燥得到用于固定化酶的明胶-二氧化硅杂化微球。本专利技术提出的制备方法的优点在于：制备条件温和，制备工艺简单易行，明胶微球粒度均一，二氧化硅含量及壳层厚度可控，并且所得明胶-二氧化硅杂化微球对过氧化氢酶具有很好的固定能力，固定化过氧化氢酶的对酸碱耐受性能强，储存稳定性好。附图说明图1为实施例1制得的明胶微球的扫描电镜（SEM）照片。图2为对比例1制备的明胶微球的扫描电镜（SEM）照片。图3为实施例1制备的明胶-二氧化硅杂化微球与对比例1制备的明胶微球的热重分析曲线图。具体实施方式为便于理解本专利技术，本专利技术列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是为了帮助理解本专利技术，不应视为对本专利技术的具体限制。实施例1膜乳化法制备固定化过氧化氢酶的明胶二氧化硅杂化微球：向200转/分钟磁力搅拌、55℃的2毫升水中加入0.2克明胶干粉，维持此速度下磁力搅拌0.5小时，至明胶干粉完全溶解于水中，溶解后明胶浓度为0.1克/毫升。向0.1克/毫升的明胶溶液中加入过氧化氢酶0.2毫克，溶解后过氧化氢酶浓度为0.1毫克/毫升。以上述过氧化氢酶/明胶水溶液作为水相。将油溶性乳化剂0.3g司班-80加入到12毫升的液体石蜡中，以200转/分钟速度磁力搅拌30分钟，至司班-80完全溶解，并将上述溶液加热至60℃作为油相。将3毫升正硅酸乙酯与0.7毫升去离子水混合。加入0.2毫升0.1摩尔/升的盐酸为催化剂，然后用超声波清洗器在室温下超声直至得到澄清透明的溶液，然后用去离子水将上述溶液稀释至50mM，并且用0.5摩尔/升的NaOH溶液将pH值调至7.0，从而得到正硅酸乙酯水解液。预乳化过程：按水相明胶/过氧化氢酶溶液与油相液体石蜡油的体积比为1:6，在温度550℃下，将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中，1600rpm速度下磁力搅拌得到粗乳液。膜乳化过程：采用管状ShirasuPorousGlass微孔膜（SPG微孔膜）。膜管直径为1厘米，长度为2厘米，膜孔径为3.5微米。使用前需要预先将微孔膜浸润于在预热至55℃的液体石蜡中30分钟，然后将微孔膜装入膜乳化装置中，膜乳化装置结构见附图1。快速将上述制备好的粗乳液加入膜乳化装置，通入氮气，在50kPa压力本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定过氧化氢酶的明胶‑二氧化硅杂化微球的方法，该方法采用包括微孔膜组件的装置，以微孔膜渗透乳化过程为主加以实现的，其特征在于包括以下步骤：1）在容器中，于温度为40℃‑70℃及搅拌下将固体明胶溶解于去离子水中，配制成浓度为0.05‑0.5克/毫升的明胶溶液，再向其中加入溶解过氧化氢酶，使过氧化氢酶浓度保持为0.1‑2毫克/升，制得水相明胶/过氧化氢酶溶液；2）在容器中，于温度为40℃‑70℃及搅拌下将油溶性乳化剂司班‑80加入到液体石蜡中，配制成含有司班‑80质量浓度为0.25‑4.0% 的液体石蜡油，称为油相；3）按步骤1）制的水相明胶/过氧化氢酶溶液与步骤2）制的油相液体石蜡油的体积比为1:（2~15），在温度40℃‑70℃及200‑1200rpm速度下搅拌下，将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中，得到粗乳液；4）将步骤3）制的粗乳液加入装配有膜孔径为3.5‑10.2微米的微孔膜的膜乳化装置内，以20kPa‑50kPa压力使粗乳液通过微孔膜腔,进入收集器后，再回加入膜乳化器中，如此循环2‑10次，得到多级乳化的W/O型乳液；5）以正硅酸乙酯与去离子水按摩尔比为1:（0.05‑0.4）混合，并向该混合中，按催化剂盐酸与正硅酸乙酯摩尔比为（0.005‑0.02）:1加入盐酸，然后在室温下超声振荡直至得到澄清透明的溶液，再用去离子水稀释溶液至浓度20‑150mM，并且用NaOH将稀释溶液的pH值调至6.0‑8.0，得到正硅酸乙酯水解液；6）在400rpm速度搅拌下，以步骤5）制得的正硅酸乙酯水解液与步骤4）制得的多级乳化W/O型乳液按体积比为1:（1.0‑4.0），将多级乳化W/O型乳液加入正硅酸乙酯水解液中，加毕后在温度0℃‑8℃冰水浴中，交联固化0.5‑4小时后，再分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至去除油相为止，然后在空气中自然干燥得到用于固定化酶的明胶‑二氧化硅杂化微球。...
【技术特征摘要】
1.一种固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球的方法，该方法采用包括微孔膜组件的装置，以微孔膜渗透乳化过程为主加以实现的，其特征在于包括以下步骤：1）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将固体明胶溶解于去离子水中，配制成浓度为0.05-0.5克/毫升的明胶溶液，再向其中加入溶解过氧化氢酶，使过氧化氢酶浓度保持为0.1-2毫克/升，制得水相明胶/过氧化氢酶溶液；2）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将油溶性乳化剂司班-80加入到液体石蜡中，配制成含有司班-80质量浓度为0.25-4.0%的液体石蜡油，称为油相；3）按步骤1）制的水相明胶/过氧化氢酶溶液与步骤2）制的油相液体石蜡油的体积比为1:（2~15），在温度40℃-70℃及200-1200rpm速度下搅拌下，将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中，得到粗乳液；4）将步骤3）制的粗乳液加入装配有膜孔径为3.5-10.2微米的微孔...
【专利技术属性】
技术研发人员：李健，马俊，姜涛，陈延辉，王艳环，闫冰，邵怀启，曹晨刚，李明凯，姚月，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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