【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物催化，尤其涉及手性化合物的制备，具体的涉及卤醇脱卤酶突变体及其在制备手性噁唑烷酮中的应用。
技术介绍
1、噁唑烷酮是一类含氧、含氮的五元杂环化合物，是有机合成领域应用最广泛的手性助剂之一。1987年，其抗菌活性首次被发现(slee a m, wuonola m a, mcripley r j,et al. oxazolidinones, a new class of synthetic antibacterial agents: invitro and in vivo activities of dup 105 and dup 721[j]. antimicrobial agentsand chemotherapy, 1987, 31: 1791-1797)，作为药物中的关键模块，广泛应用于抗菌、抗凝血、抗哮喘、免疫抑制剂领域(neu h c, novelli a, saha g, et al. in vitroactivities of two oxazolidinone antimicrobial agents, dup721 and dup 105[j].antimicrobial agents and chemotherapy, 1988, 32: 580-583;bozdogan b,appelbaum p c. oxazolidinones: activity, mode of action, and mechanism ofresistance[j]. international journal
2、手性4,5-双取代-2-噁唑烷酮是许多天然产物、药物合成的核心模块，从链霉菌中分离获得的天然产物(-)-cytoxazone，被鉴定为th2细胞因子分泌的选择性调节因子(miranda i l, lopes i k, diaz m a, et al. synthesis approaches to (-)-cytoxazone, a novel cytokine modulator, and related structures[j]. molecules,2016, 21: 1176)；百时美施贵宝公司开发的手性4,5-双取代-2-噁唑烷酮bms-958829，具有良好的代谢型谷氨酸受体5（mglur5）结合亲和力、低谷氨酸折叠位移，以及对mglur5亚型的高选择性，并且临床安全性良好。双取代-2-噁唑烷酮也是有机合成领域应用最广泛的手性助剂之一，已经被应用到许多立体选择性反应中，包括羟醛缩合反应、烷基化反应和diels-alder反应，它通过4-和5-取代的噁唑烷酮空间位阻（立体阻碍）差异提供手性识别环境。
3、化学合成中，通常以手性1,2-氨基醇作为初始材料，通过环化反应合成，但需要有毒或危险试剂(光气或其衍生物)、剧烈的反应条件(强碱或非常高/低的温度和压力)，当合成双取代噁唑烷酮时需要用到的手性底物获得困难，无疑为合成增加了难度，利用硫叶立德和硝基烯为底物，在手性硫脲和4-二甲氨基吡啶的共同催化作用下环化合成4,5-二取代噁唑烷-2-得了良好的进展。以双取代烯烃为底物，在手性催化剂催化下，通过不对称的羟胺化反应生成酰胺中间体，随后在碱性条件下关环可以合成手性的4,5-二取代噁唑烷-2-酮，反应过程中使用了大量的化学试剂，而且产物是由4-取代和5-取代噁唑烷-2-酮两种同分异构体组成的混合物。采用卤醇脱卤酶催化环氧化物制备手性噁唑烷酮只实现了( r)-4-芳基-噁唑烷-2-酮的合成，对复杂双取代噁唑烷酮合成活性和选择性低，鲜有研究。
4、因此，开发一种绿色高效的，高区域选择性、高立体选择性合成手性双取代噁唑烷酮的方法是非常必要的。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是如何通过酶法制备手性4,5-双取代噁唑烷酮。本专利技术有两个内容：第一是通过卤醇脱卤酶动力学拆分，以外消旋的2,3-双取代环氧化物为底物，制备手性4,5-双取代噁唑烷酮化合物的方法；第二是通过卤醇脱卤酶和羰基还原酶串联，以α-酮酸酯为底物，制备手性4,5-双取代噁唑烷酮化合物的方法。
2、本专利技术首先提供一种卤醇脱卤酶突变体，其在对应于seq id no. 1的氨基酸序列的第1至226位中存在下述之一的突变：f92v；y21m、f92v且n188g；y21m、n188g且f195a。
3、本专利技术还提供了所述的卤醇脱卤酶突变体和羰基还原酶的编码基因，编码基因的表达载体，编码基因的重组细胞。
4、本专利技术进而提供如seq id no. 1的所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或所述的卤醇脱卤酶突变体在制备手性噁唑烷酮中的应用。
5、本专利技术提供一种合成手性4-取代苯基噁唑烷酮的方法，其是以下式i的消旋或手性环氧取代苯乙烷化合物作为底物催化反应合成式ii的手性4-取代苯基噁唑烷酮：
6、
7、r1=苄基，苯基， m-甲基苯基， o-甲氧基苯基， p-甲氧基苯基， m-甲氧基苯基；r2=甲酸乙酯基；所述催化采用的催化剂为如seq id no. 1的所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体。
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1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，在对应于SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的第1至252位中存在下述之一的突变：
2.如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的编码基因。
3.含有如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体编码基因的表达载体。
4.含有如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组细胞。
5.如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体在制备手性噁唑烷酮中的应用。
6.一种合成手性4-取代苯基噁唑烷酮的方法，其特征在于，是以下式I的消旋或手性环氧取代苯乙烷化合物作为底物催化反应合成式II的手性4-取代苯基噁唑烷酮：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化反应是以表达如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或如权利要求1所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以消旋2,3-双取代环氧化合物为底物，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在20℃-50℃条件下进行反应。>
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化反应中，反应体系中的催化底物浓度为20-150 g/L，含有菌体量为10-150 g/L，反应体系的pH为6.0-9.0，反应温度为20℃-35℃。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在反应体系还添加有乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,4-二氧六环中的一种作为助溶剂。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，以反式-3-苯基环氧乙烷-2-甲酸乙酯底物，制备得到(4R,5R)-4-苯基-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(2-甲氧基苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5R)-4-(2-甲氧基苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(3-甲氧基苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5R)-4-(3-甲氧基苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(4-甲氧基苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5R)-4-(4-甲氧基苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(2-甲基苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5R)-4-(2-甲基苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(3-甲基苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5R)-4-(3-甲基苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(2-溴苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5R)-4-(2-溴苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(3-溴苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5R)-4-(3-溴苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(2-萘基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5R)-4-(2-萘基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以顺式-3-苯基-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4R,5S)-4-苯基-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以顺式-3-苯基-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4S,5R)-4-苯基-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮。
11.一种合成手性(4,5)-双取代噁唑烷酮的方法，其特征在于，以消旋的2-氯-3-羰基-3-苯基丙酸乙酯为底物级联羰基还原酶和卤醇脱卤酶级联催化反应合成手性(4,5)-双取代噁唑烷酮。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述级联催化反应是以表达如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶和如SEQ ID NO. 3所示羰基还原酶的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-氯-3-羰基-3-苯基丙酸乙酯为底物，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在20℃-50℃条件下进行反应。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述级联催化反应中，反应体系中的催化底物浓度为20-150 g/L，含有两种菌体的量分别为10-150 g/L，反应体系的pH为6.0-9.0，反应温度为20℃-35℃。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在反应体系还添加有乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,4-二氧六环中的一种或多种作为助溶剂。
15.如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体在与卤醇脱卤酶级联催化制备手性噁唑烷酮中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，在对应于seq id no. 1的氨基酸序列的第1至252位中存在下述之一的突变：
2.如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的编码基因。
3.含有如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体编码基因的表达载体。
4.含有如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组细胞。
5.如seq id no. 1所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体在制备手性噁唑烷酮中的应用。
6.一种合成手性4-取代苯基噁唑烷酮的方法，其特征在于，是以下式i的消旋或手性环氧取代苯乙烷化合物作为底物催化反应合成式ii的手性4-取代苯基噁唑烷酮：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化反应是以表达如seq id no. 1或seq id no. 2所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或如权利要求1所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以消旋2,3-双取代环氧化合物为底物，以ph为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在20℃-50℃条件下进行反应。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化反应中，反应体系中的催化底物浓度为20-150 g/l，含有菌体量为10-150 g/l，反应体系的ph为6.0-9.0，反应温度为20℃-35℃。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在反应体系还添加有乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,4-二氧六环中的一种作为助溶剂。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，以反式-3-苯基环氧乙烷-2-甲酸乙酯底物，制备得到(4r,5r)-4-苯基-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(2-甲氧基苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4r,5r)-4-(2-甲氧基苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(3-甲氧基苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4r,5r)-4-(3-甲氧基苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(4-甲氧基苯基)-环氧乙烷-2-甲酸乙酯为底物，制备得到(4r,5r)-4-(4-甲氧基苯基)-5-甲酸乙酯-2-噁唑烷酮；以反式-3-(2...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴洽庆，周传华，陈曦，冯进辉，朱敦明，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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