【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物工程领域，具体地涉及一种生产新橙皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的方法。
技术介绍
1、新橙皮苷(neohesperidin)是从柑橘植物中的一种天然新型营养甜味剂，其经氢化而得的新橙皮苷二氢查尔酮(neohesperidin dihydrochalcone，nhdc)，甜度更是蔗糖的1500-2000倍，还具有热量小、甜味作用时间长、稳定性好等特征。两者被广泛应用在食品科学及医学等方面。新橙皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的结构如下图所示：
2、
3、目前，新橙皮苷主要来源于天然植物的纯化萃取，其生产工艺复杂，且容易受到气候影响。而由于新橙皮苷在天然植物中普遍含量较低，新橙皮苷二氢查尔酮价格也比较昂贵。
4、因此，需要开发一种不依赖于植物的黄酮糖苷类化合物的获取方式。对新橙皮苷的生物合成方法，存在着未满足的需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种在解脂耶氏酵母中利用甘油从头合成新橙皮苷的方法。通过将一种解脂耶氏酵母来源的黄酮o-甲基转移酶(ylomt)和其他植物来源的黄酮合成酶转入解脂耶氏酵母，构建的底盘细胞能从头合成新橙皮苷，继续对新橙皮苷进行氢化获得新橙皮苷二氢查尔酮。本专利技术转入的解脂耶氏酵母来源的黄酮o-甲基转移酶相比于转入植物来源的黄酮o-甲基转移酶活性更好，得到的从甘油合成新橙皮苷在摇瓶中的产量高，具有开发应用潜力。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术
3、第一方面，本专利技术提供一种从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述工程菌包含苯丙氨酸解氨酶pal，肉桂酸4-羟化酶c4h，4-香豆酰辅酶a连接酶4cl，查尔酮合酶chs，黄酮类化合物3’-单加氧酶f3’h，细胞色素p450还原酶cpr，黄酮o-甲基转移酶omt，黄烷酮7-o-β-d-葡萄糖基转移酶ugt，鼠李糖基转移酶rhat和udp-l-鼠李糖合酶rhm。
4、优选地，所述黄酮o-甲基转移酶omt来源于解脂耶氏酵母，具有与seq id no:7中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有黄酮o-甲基转移酶活性。
5、进一步优选地，所述黄酮o-甲基转移酶omt具有与seq id no:17中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的核苷酸序列编码。
6、优选地，上述从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌中，
7、所述苯丙氨酸解氨酶pal具有与seq id no:1中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有苯丙氨酸解氨酶活性；
8、所述肉桂酸4-羟化酶c4h具有与seq id no:2中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有肉桂酸4-羟化酶活性；
9、所述4-香豆酰辅酶a连接酶4cl具有与seq id no:3中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有4-香豆酰辅酶a连接酶活性；
10、所述查尔酮合酶chs具有与seq id no:4中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有查尔酮合酶活性；
11、所述黄酮类化合物3’-单加氧酶f3’h具有与seq id no:5中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有黄酮类化合物3’-单加氧酶活性；
12、所述细胞色素p450还原酶cpr具有与seq id no:6中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有细胞色素p450还原酶活性；
13、所述黄烷酮7-o-β-d-葡萄糖基转移酶ugt具有与seq id no:8中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有黄烷酮7-o-β-d-葡萄糖基转移酶活性；
14、所述鼠李糖基转移酶rhat具有与seq id no:9中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有鼠李糖基转移酶活性；
15、所述udp-l-鼠李糖合酶rhm具有与seq id no:10中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有udp-l-鼠李糖合酶活性；
16、上述酶均为异源的；优选为植物来源；
17、进一步优选地，所述苯丙氨酸解氨酶pal、肉桂酸4-羟化酶c4h、4-香豆酰辅酶a连接酶4cl、查尔酮合酶chs来源于灯盏花；所述黄酮类化合物3’-单加氧酶f3’h来源于甜橙；所述细胞色素p450还原酶cpr、黄烷酮7-o-β-d-葡萄糖基转移酶ugt、udp-l-鼠李糖合酶rhm来源于拟南芥；所述鼠李糖基转移酶rhat来源于柚子。
18、第二方面，本专利技术提供第一方面所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产新橙皮苷和/或新橙皮苷二氢查尔酮中的应用。
19、第三方面，本专利技术提供第一方面所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在以甘油为底物生产新橙皮苷和/或新橙皮苷二氢查尔酮中的应用。
20、第四方面，本专利技术提供黄酮o-甲基转移酶ylomt在解脂耶氏酵母利用甘油合成新橙皮苷和/或新橙皮苷二氢查尔酮中的应用，所述黄酮o-甲基转移酶omt来源于解脂耶氏酵母，具有与seq id no:7中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有黄酮o-甲基转移酶活性。
21、优选地，上述应用中所述黄酮o-甲基转移酶omt具有与seq id no:17中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述工程菌包含苯丙氨酸解氨酶PAL，肉桂酸4-羟化酶C4H，4-香豆酰辅酶A连接酶4CL，查尔酮合酶CHS，黄酮类化合物3’-单加氧酶F3’H，细胞色素P450还原酶CPR，黄酮O-甲基转移酶OMT，黄烷酮7-O-β-D-葡萄糖基转移酶UGT，鼠李糖基转移酶RHAT和UDP-L-鼠李糖合酶RHM。
2.根据权利要求1所述的从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述黄酮O-甲基转移酶OMT来源于解脂耶氏酵母，具有与SEQ ID NO:7中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有黄酮O-甲基转移酶活性。
3.根据权利要求2所述的从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述黄酮O-甲基转移酶OMT具有与SEQ ID NO:17中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100
4.根据权利要求1-3任一项所述的从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，
5.权利要求1-4任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产新橙皮苷和/或新橙皮苷二氢查尔酮中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在以甘油为底物生产新橙皮苷和/或新橙皮苷二氢查尔酮中的应用。
7.黄酮O-甲基转移酶YlOMT在解脂耶氏酵母利用甘油合成新橙皮苷和/或新橙皮苷二氢查尔酮中的应用，所述黄酮O-甲基转移酶OMT来源于解脂耶氏酵母，具有与SEQ ID NO:7中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有黄酮O-甲基转移酶活性。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述黄酮O-甲基转移酶OMT具有与SEQ IDNO:17中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
9.一种生产新橙皮苷的方法，包括如下步骤：以甘油为底物，将权利要求1-4任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在发酵培养基中培养发酵，获得新橙皮苷。
10.一种生产新橙皮苷二氢查尔酮的方法，包括如下步骤：依据权利要求9所述的生产新橙皮苷的方法，获得新橙皮苷粗品，溶解于4％～15％氢氧化钠和/或氢氧化钾溶液之中，加入催化剂钯碳后，氢气置换反应体系的空气，氢气常压条件下，25～30℃反应24-72h。反应结束后抽滤，取滤液用浓盐酸和/或浓硫酸调节pH值至中性；然后在4～8℃下析晶24～96h，抽滤后得到的白色滤饼即为新橙皮苷二氢查尔酮粗品。
...【技术特征摘要】
1.一种从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述工程菌包含苯丙氨酸解氨酶pal，肉桂酸4-羟化酶c4h，4-香豆酰辅酶a连接酶4cl，查尔酮合酶chs，黄酮类化合物3’-单加氧酶f3’h，细胞色素p450还原酶cpr，黄酮o-甲基转移酶omt，黄烷酮7-o-β-d-葡萄糖基转移酶ugt，鼠李糖基转移酶rhat和udp-l-鼠李糖合酶rhm。
2.根据权利要求1所述的从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述黄酮o-甲基转移酶omt来源于解脂耶氏酵母，具有与seq id no:7中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的氨基酸序列并具有黄酮o-甲基转移酶活性。
3.根据权利要求2所述的从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述黄酮o-甲基转移酶omt具有与seq id no:17中所示全长序列之间同源的程度至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性的核苷酸序列编码。
4.根据权利要求1-3任一项所述的从甘油合成新橙皮苷的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，
5.权利要求1-4任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产新橙皮苷和/或新橙皮苷二氢查尔酮中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：江会锋，祝晓熙，刘晓楠，程健，刘玉万，卢丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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