【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种生产桂叶苷b和毛蕊花糖苷的基因工程菌、该基因工程菌在生产桂叶苷b和毛蕊花糖苷中的应用、以及一种生产桂叶苷b和毛蕊花糖苷的方法。
技术介绍
1、苯乙醇苷类化合物（phenylpropanoid glycosides,phgs）是一类广泛分布在唇形目植物中的一类天然酚酸类化合物，具有抗氧化、抗癌、增强学习和记忆等功能。化学结构上，这类化合物以红景天苷为母核结构，在核心葡萄糖基团上发生酰基化、糖基化等修饰。其中，葡萄糖基团c3羟基基团被鼠李糖基基团取代的phgs最具有代表性，毛蕊花糖苷、松果菊苷等“明星分子”均属于这类化合物。这类化合物的共同前体是桂叶苷b（osmanthusideb）。
2、毛蕊花糖苷（verbascoside）是植物酚酸类化合物，是多种药用植物的重要活性物质，在人类文明中的应用由来已久。比如，毛蕊花糖苷是我国传统药用植物地黄、肉苁蓉的主要活性成分之一，中华药典规定毛蕊花糖苷的含量是这些药材品质的参考标准之一；此外，毛蕊花糖苷是北美、欧洲等常用药用植物如紫锥菊、车前的提取物中的重要活性物质之一。近三十年来，对毛蕊花糖苷进行的药理学研究表明，毛蕊花糖苷具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用，并且对神经系统损伤修复、消化系统调节、免疫系统调节等具有重要作用，因此，在新药开发上具有巨大潜力。
3、目前，桂叶苷b、毛蕊花糖苷的生产主要源于植物提取。该类方法存在一些固有局限，比如受耕地面积、受天气环境影响、生产周期长等因素的制约，以及由于含量低、化合物组分复杂而
4、随着合成生物学技术的进步，以环境友好的微生物发酵法生产植物天然产物成为发展趋势。然而目前尚无生产桂叶苷b、毛蕊花糖苷的工程菌株及其应用的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种新的能够生产桂叶苷b、毛蕊花糖苷的基因工程菌，该基因工程菌能够通过微生物发酵法生产桂叶苷b和毛蕊花糖苷。本专利技术的专利技术人通过大量的研究，构建了含有能够编码丙酮酸脱羧酶aro10的基因，能够编码4-香豆酸:辅酶a连接酶4cl的基因，能够编码udp葡萄糖基转移酶ugt的基因，能够编码酰基转移酶的bahd-at基因，编码udp鼠李糖基转移酶urt的基因的基因工程菌，在葡萄糖、香豆酸的存在下，实现了桂叶苷b（式i所示，英文名为osmanthuside b）的微生物合成；同时再在基因工程菌中引入细胞色素p450酶cyp基因和编码细胞色素p450酶还原酶cpr的基因，在葡萄糖、香豆酸的存在下，实现了桂叶苷b、毛蕊花糖苷（式ii所示，英文名为verbascoside）的微生物合成。并且通过本专利技术提供的基因工程菌获得的如上产物的产量可达毫克级。
2、式i式ii
3、基于如上的发现，一方面，本专利技术提供了一种提供了一种生产如上所述的桂叶苷b和毛蕊花糖苷的基因工程菌，该基因工程菌含有能够编码丙酮酸脱羧酶aro10的基因，能够编码4-香豆酸:辅酶a连接酶4cl的基因，能够编码udp葡萄糖基转移酶ugt的基因，能够编码酰基转移酶的bahd-at基因，编码udp鼠李糖基转移酶urt的基因。
4、优选的，所述基因工程菌还含有细胞色素p450酶cyp的基因和编码细胞色素p450酶还原酶cpr的基因。
5、第二方面，本专利技术提供了如上所述的基因工程菌在生产桂叶苷b和毛蕊花糖苷中的应用。
6、第三方面，本专利技术提供了一种生产桂叶苷b和毛蕊花糖苷的方法，在含葡萄糖和香豆酸的培养基中培养如上所述的基因工程菌，并诱导外源基因的表达以生产桂叶苷b和毛蕊花糖苷。
7、本专利技术的生产桂叶苷b的基因工程菌，可以发酵生产桂叶苷b，桂叶苷b的产量最高可达67.7mg/l；在进一步引入编码细胞色素p450酶基因、编码细胞色素p450酶还原酶cpr的基因，以及在葡萄糖、香豆酸的存在下，还可以生产化合物毛蕊花糖苷，产量为5mg/l桂叶苷b和2.2mg/l毛蕊花糖苷。因此，本专利技术提供了一种生产桂叶苷b、毛蕊花糖苷的新的基因工程菌，为桂叶苷b和/或毛蕊花糖苷的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的科研价值和社会效益。
8、专利技术详述：下面对本专利技术进行详细的描述。
9、在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
10、第一方面，本专利技术公开了一种生产桂叶苷b、毛蕊花糖苷的基因工程菌，该基因工程菌含有能够编码丙酮酸脱羧酶aro10的基因，能够编码4-香豆酸:辅酶a连接酶4cl的基因，能够编码udp葡萄糖基转移酶ugt的基因，能够编码酰基转移酶的bahd-at基因，编码udp鼠李糖基转移酶urt基因。
11、根据本专利技术，当所述基因工程菌含有能够编码细胞色素p450酶cyp的基因和编码细胞色素p450酶还原酶cpr的基因时，其可以生物合成毛蕊花糖苷。
12、其中，桂叶苷b具有以下特征：英文名称osmanthuside b，分子式c29h36o13，分子量592.21，cas号94492-23-6，结构式如下：
13、；
14、毛蕊花糖苷具有以下特征：英文名verbascoside，分子式c29h36o15，分子量624.59，cas号61276-17-3，结构式如下：
15、。
16、根据本专利技术一种具体的实施方式，所述基因工程菌的外源基因为能够编码丙酮酸脱羧酶aro10的基因，能够编码4-香豆酸:辅酶a连接酶4cl的基因，能够编码udp葡萄糖基转移酶ugt的基因，能够编码酰基转移酶的bahd-at基因，编码udp鼠李糖基转移酶urt的基因，其可以生物合成如上式i所示的化合物桂叶苷b。
17、根据本专利技术一种具体的实施方式，所述基因工程菌的外源基因为能够编码丙酮酸脱羧酶aro10的基因，能够编码4-香豆酸:辅酶a连接酶4cl的基因，能够编码udp葡萄糖基转移酶ugt的基因，能够编码酰基转移酶的bahd-at基因，编码udp鼠李糖基转移酶urt的基因，编码使桂叶苷b的苯环基团c3位置发生羟基化的细胞色素p450酶cyp的基因和编码细胞色素p450酶还原酶cpr的基因，其可以生物合成如上式ii所示的化合物毛蕊花糖苷，还可以生物合成如上式i所示的化合物桂叶苷b。
18、根据本专利技术，术语“丙酮酸脱羧酶aro10”为丙酮酸脱羧酶pyruvatedecarboxylase,缩写aro10，是催化直接脱掉酪氨酸上的羧基而生成对羟基苯乙醛的酶，其可以为各种来源，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产桂叶苷B和/或毛蕊花糖苷的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌含有能够编码丙酮酸脱羧酶ARO10的基因，能够编码4-香豆酸:辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，能够编码酰基转移酶的BAHD-AT基因，编码UDP鼠李糖基转移酶URT的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述UDP葡萄糖基转移酶UGT为UDP葡萄糖基转移酶UGT85AF8；优选的，所述能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因为来自粗壮女贞的LrUGT85AF8基因，其GenBank登录号为MZ73460。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述酰基转移酶的BAHD-AT为酰基转移酶SiAT1；优选的，所述能够编码BAHD-AT的基因为来自芝麻的SiAT1基因，其GenBank登录号为XM_011085581.2。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述UDP鼠李糖基转移酶URT为UDP鼠李糖基转移酶UGT79G15；优选的，所述能够编码UDP鼠李糖基转移酶UGT的基因为来自地黄的RgUGT7
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码丙酮酸脱羧酶ARO10的基因为来自酿酒酵母的ARO10基因，其GenBank登录号为NM_001180688.3。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码4-香豆酸:辅酶A连接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或者为来自拟南芥的At4CL基因，其GenBank登录号为AY099747.1。
7.根据权利要求1至6任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还含有能够编码细胞色素P450酶CYP的基因和/或能够编码细胞色素P450酶还原酶CPR的基因；优选地，所述细胞色素P450酶CYP为CYP98A20（更具体地，其Genbank登录号：NM_001304410.1），更优选为CYP98A20的突变体2C3CYP98A20Δ27，2C3CYP98A20Δ27的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；或者所述能够编码细胞色素P450酶CYP的基因为来自青蒿的AaCPR基因（更具体地，其Genbank登录号：DQ318192.1），AaCPR基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
8.根据权利要求1至6任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌；优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α；更优选地，所述大肠杆菌为高产酪氨酸的大肠杆菌；优选地，所述高产酪氨酸的大肠杆菌不表达tyrR、pheA和trpE基因。
9.权利要求1至8任意一项所述的基因工程菌在生产桂叶苷B和毛蕊花糖苷中的应用。
10.一种生产桂叶苷B和毛蕊花糖苷的方法，其特征在于，在含葡萄糖的培养基中培养权利要求1至8任意一项所述的基因工程菌，并诱导外源基因的表达以生产桂叶苷B和/或毛蕊花糖苷；任选地，还包括分离桂叶苷B和/或毛蕊花糖苷的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种生产桂叶苷b和/或毛蕊花糖苷的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌含有能够编码丙酮酸脱羧酶aro10的基因，能够编码4-香豆酸:辅酶a连接酶4cl的基因，能够编码udp葡萄糖基转移酶ugt的基因，能够编码酰基转移酶的bahd-at基因，编码udp鼠李糖基转移酶urt的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述udp葡萄糖基转移酶ugt为udp葡萄糖基转移酶ugt85af8；优选的，所述能够编码udp葡萄糖基转移酶ugt的基因为来自粗壮女贞的lrugt85af8基因，其genbank登录号为mz73460。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述酰基转移酶的bahd-at为酰基转移酶siat1；优选的，所述能够编码bahd-at的基因为来自芝麻的siat1基因，其genbank登录号为xm_011085581.2。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述udp鼠李糖基转移酶urt为udp鼠李糖基转移酶ugt79g15；优选的，所述能够编码udp鼠李糖基转移酶ugt的基因为来自地黄的rgugt79g15基因，其genbank登录号为mz734613。
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码丙酮酸脱羧酶aro10的基因为来自酿酒酵母的aro10基因，其genbank登录号为nm_001180688.3。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码4-香豆酸:辅酶a连接酶4cl的基因核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，杨一涵，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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