本发明专利技术公开了一种乳制品中耐热蛋白酶基因双重ddPCR定量检测方法，使用针对耐热蛋白酶编码基因AT03_15745基因和CNY62_09470基因作为靶序列设计的引物和探针的组合。本发明专利技术的乳制品中耐热蛋白酶AT03_15745基因和CNY62_09470基因的双重ddPCR定量检测方法具有良好的特异性，同其他乳制品常见乳酸菌和食源性致病菌均无交叉反应，适用于乳原料及其加工品中耐热蛋白酶基因的快速定量检测。
1、在原料乳的加工过程中经过巴氏杀菌和超高温灭菌，嗜冷菌虽已死亡，但其产生的热稳定酶(脂肪酶、蛋白酶等)仍具有一定活性，在低温贮藏时酶的活性逐渐被激活，它能分解乳制品中的脂肪和蛋白质，使产品发生褐变反应、胶凝化现象，出现腐臭、苦味、异味等不良风味，导致乳制品苦味包、酸包、变色发黏等变质现象，进而影响乳制品的货架期，使货架期变短。
2、《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》(ny/t 1331-2007)参考了iso 6730：1992《milk—enumeration of colony-forming units of psychrotrophicmicro-organisms—colony-count technique at 6,5degrees c》中关于嗜冷菌检测的相关要求，建立了嗜冷菌检测的国家推荐性标准方法。该方法主要以低温下乳平板培养计数，检测耗时长，检测结果准确度受检测人员主观影响较大。关于嗜冷菌的检测技术研究还涉及：3m纸片法、直接外荧光过滤(deft)、流式细胞计数(fcm)、实时pcr检测(rt-pcr)、瞬时温度梯度凝胶电泳(ttge)、atp生物发光等技术。然而，目前各种嗜冷菌的检测方法都存在耗时长，特异性不高，容易产生假阳性反应等不足之处。同时，针对原料乳及乳制品热稳定性蛋白酶和脂肪酶的检测方法，如：显色、琼脂扩散、酶联免疫等检测方法，检出限较高，实用性不强。
>3、微滴式数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)作为一种新兴的检测技术已被成功用于临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测等领域。例如2017年赵丽青等利用ddpcr技术定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌，检出限为(3.6±0.1)copies/20μl。2018年方佩佩等采用ddpcr技术建立副溶血性弧菌快速定量检测，研究表明ddpcr定量检测技术特异性良好、灵敏度高、结果准确。2018年gobert等研究表明ddpcr对较低数量的活细胞的定量效果最好，ddpcr在干扰菌背景下，无需建立标准曲线，就可以对少量活菌细胞进行特异性定量。2020年he l等利用ddpcr同时检测大肠杆菌o157:h7和o104:h4，以stx和o抗原特异性基因为靶基因，通过使用taqman探针对人工污染的苹果汁、牛奶和菠菜洗液进行定量检测。2021年roman netzer等利用数字pcr技术对水产养殖中重点细菌进行绝对定量。上述研究均为乳制品中耐热蛋白酶基因的ddpcr检测研究奠定了基础。
技术实现思路
1、为实现对特异性耐热蛋白酶基因的检测和绝对定量分析，本申请的专利技术人通过乳制品宏基因组测序及蛋白酶耐热性预测，选取了耐热蛋白酶编码基因at03_15745基因和cny62_09470基因作为靶序列，分别设计了引物和探针组合。经qpcr验证，验证了一组对于这两个基因具有很好的特异性的引物和探针，并且经ddpcr验证，用于这两种耐热酶基因的检测具有良好的重复性。
2、因此，本专利技术的第一个方面，提供了一种乳制品中耐热蛋白酶基因双重ddpcr定量检测方法，使用针对耐热蛋白酶编码基因at03_15745基因和cny62_09470基因作为靶序列设计的引物和探针的组合。
3、根据本专利技术的优选实施例，所述针对at03_15745基因设计的引物和探针组合的序列如下：
4、正向引物p-aiu73693-f：tggcagaagaagcgctcttt(seq in no.4)；
5、正向引物p-aiu73693-r：gcgggaaggtggcctaac(seq in no.5)；
6、探针p-aiu73693-p：ctatctgcagcaacgcctcagcgg(seq in no.6)；
7、所述针对cny62_09470基因设计的引物和探针组合的序列如下：
8、正向引物p-atf26596-f：caaatagcacgcccattaagttag(seq in no.1)；
9、反向引物p-atf26596-r：catccacgattacagctatcatcaa(seq in no.2)；
10、探针p-atf26596-p：tgttttccgattgttcgagccctcc(seq in no.3)。
11、进一步的，所述双重ddpcr的反应体系如下：
12、ddpcr master mix for probes(no dutp)10μl，第一个检测靶基因的上、下游引物各0.5μl(终浓度125nmol/l～1000nmol/l)，探针0.25μl(终浓度125nmol/l)，第二个检测靶基因的上、下游引物各0.5μl(终浓度125nmol/l～1000nmol/l)，探针0.25μl(终浓度125nmol/l)，样品dna模板2μl，用双蒸水补足总体积20μl；
13、进一步的，所述ddpcr的扩增反应条件如下：
14、95℃预变性10min；94℃变性30s，50～60℃退火1min，40个循环；98℃固化微滴10min。
15、优选的，所述用于ddpcr扩增的引物终浓度为250nmol/l。优选的，所述退火温度为58℃。
16、根据本专利技术，所述ddpcr测定结果与对应样品的耐热酶基因拷贝数浓度的换算公式如以下式(1)：
17、
18、式(1)中：c1为对应耐热酶基因拷贝数浓度(copies/ml)；n为20μl ddpcr反应体系中测得的核酸拷贝数(copies/20μl)；v1为提取核酸的最终定容体积(μl)；v2为ddpcr反应体系中加入的核酸模板体积(μl)；v3为提取的菌悬液体积(ml)。
19、本专利技术的第二个方面，提供了一种使用针对耐热蛋白酶编码基因at03_15745基因和cny62_09470基因作为靶序列设计的引物和探针的组合，用于乳制品中耐热蛋白酶基因双重ddpcr定量检测，其中：
20、所述针对at03_15745基因设计的引物和探针组合的序列如下：
21、正向引物p-aiu73693-f：tggcagaagaagcgctcttt(seq in no.4)；
22、正向引物p-aiu73693-r：gcgggaaggtggcctaac(seq in no.5)；
23、探针p-aiu73693-p：ctatctgcagcaacgcctcagcgg(seq in no.6)；
24、所述针对cny62_09470基因设计的引物和探针组合的序列如下：
25、正向引物p-atf26596-f：caaatagcacgcccattaagttag(seq in no.1)；
...
【技术保护点】
1.一种乳制品中耐热蛋白酶基因双重ddPCR定量检测方法，其特征在于，使用针对耐热蛋白酶编码基因AT03_15745基因和CNY62_09470基因作为靶序列设计的引物和探针的组合。
2.根据权利要求1所述的双重ddPCR定量检测方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的双重ddPCR定量检测方法，其特征在于，所述双重ddPCR的反应体系如下：
4.根据权利要求3所述的双重ddPCR定量检测方法，其特征在于，所述ddPCR的扩增反应条件如下：
5.根据权利要求3所述的双重ddPCR定量检测方法，其特征在于，所述用于ddPCR扩增的引物终浓度为250nmol/L。
6.根据权利要求4所述的双重ddPCR定量检测方法，其特征在于，所述退火温度为58℃。
7.根据权利要求3所述的双重ddPCR定量检测方法，其特征在于，所述ddPCR测定结果与对应样品的耐热酶基因拷贝数浓度的换算公式如以下式(1)：
8.一种使用针对耐热蛋白酶编码基因AT03_15745基因和CNY62_09470基因作为靶序列设计的引物和探针的组合，用于乳制品中耐热蛋白酶基因双重ddPCR定量检测，其特征在于：
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【技术特征摘要】
1.一种乳制品中耐热蛋白酶基因双重ddpcr定量检测方法，其特征在于，使用针对耐热蛋白酶编码基因at03_15745基因和cny62_09470基因作为靶序列设计的引物和探针的组合。
2.根据权利要求1所述的双重ddpcr定量检测方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的双重ddpcr定量检测方法，其特征在于，所述双重ddpcr的反应体系如下：
4.根据权利要求3所述的双重ddpcr定量检测方法，其特征在于，所述ddpcr的扩增反应条件如下：
5.根据权利要求3所述的双重ddpcr...
【专利技术属性】
技术研发人员：张奕南，刘洋，于媛媛，徐红斌，王志伟，俞漪，
申请(专利权)人：上海市质量监督检验技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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