【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组织培养，特别是涉及一种水稻悬浮细胞的建立方法。
技术介绍
1、植物细胞悬浮培养是植物细胞的微生物化，它与植物组织细胞相比具有分散性好、细胞一致性好、生长迅速、重复性好及易于控制等特点，被广泛用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究中，为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
2、水稻愈伤组织诱导培养基及悬浮细胞培养基种类较多，大部分培养基都会让愈伤组织和悬浮细胞产生褐化情况，影响愈伤组织的诱导及悬浮细胞的活性。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种水稻悬浮细胞的建立方法，本专利技术提供的建立方法能高效诱导出水稻愈伤组织，并能获得细胞团小、分散性好、均一性好且增长快的水稻悬浮细胞，并且在培养过程中未观察到愈伤组织及悬浮细胞的褐化情况。
2、细胞团小、分散性好、均一性好且增长快的水稻悬浮细胞：具体表现如下：细胞团小和分散性好，呈现为几十个细胞一下的细胞团；均一性好，表现为外观为大小均一的小颗粒，在显微镜下观察为体积和形状大致相同的细胞团；增长快，变现为接种后只需要约两天，悬浮细胞的量即可增加1倍以上。
3、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
4、本专利技术提供了一种水稻悬浮细胞的建立方法，包括以下步骤：
5、1)将水稻种子消毒后接种于诱导培养基上进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；
6、所述诱导培养基包括：kno32830mg/l、cacl2·2h2o 16
7、2)将所述步骤1)得到的胚性愈伤组织接种于继代培养基上进行继代培养，得到继代后愈伤块；
8、所述继代培养基包括：kno32830mg/l、cacl2·2h2o 166mg/l、mgso4·7h2o 135mg/l、kh2po4400mg/l、(nh4)2so4463mg/l、na2edta·2h2o 37.3mg/l、feso4·7h2o 27.8mg/l、ki0.75mg/l、h3bo33mg/l、mnso4·h2o 10mg/l、znso4·7h2o 2mg/l、na2moo4·2h2o 0.25mg/l、cuso4·5h2o 0.025mg/l、cocl2·6h2o 0.025mg/l、烟酸1mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、盐酸硫胺素10mg/l、肌醇100mg/l、2,4-d 2mg/l、l-脯氨酸2800mg/l、水解酪蛋白300mg/l、l-谷氨酸500mg/l、蔗糖30000mg/l、植物凝胶2200mg/l，ph值为5.8；
9、3)将所述步骤2)得到的继代后愈伤块接种于步骤1)所述诱导培养基上进行暗培养，得到愈伤组织；
10、4)将所述步骤3)得到的愈伤组织接种于aa液体培养基中进行振荡暗培养，得到悬浮细胞系；
11、所述aa液体培养基包括：kcl 2940mg/l、cacl2·2h2o 494mg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4170mg/l、na2edta·2h2o 37.3mg/l、feso4·7h2o 27.8mg/l、ki 0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·h2o 16.9mg/l、znso4·7h2o 8.6mg/l、na2moo4·2h2o 0.25mg/l、cuso4·5h2o 0.025mg/l、cocl2·6h2o 0.025mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.1mg/l、盐酸硫胺素0.5mg/l、肌醇100mg/l、2,4-d 2mg/l、l-谷氨酰胺877mg/l、天冬氨酸266mg/l、精氨酸288mg/l、甘氨酸75、mg/l蔗糖30000mg/l，ph值为5.8；
12、5)将所述步骤4)得到的悬浮细胞系进行振荡继代培养，得到水稻悬浮细胞。
13、优选的，所述步骤1)消毒的条件包括：将水稻种子去壳后，倒入体积百分含量为70％的乙醇溶液中消毒1～2min，倒去乙醇溶液，加入质量百分含量为30％的naclo溶液，浸泡30min，倒去naclo溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4～5遍，最后一遍浸泡30min。
14、优选的，所述步骤1)诱导培养的条件包括：温度为29～31℃，时间为3～4周，光照强度在30000lx以上。
15、优选的，所述步骤2)继代培养的条件包括：先光照培养1周再暗培养1周；
16、所述光照培养的条件包括：温度为30℃，环境湿度为70％，光照强度在30000lx以上；
17、所述暗培养的条件包括：温度为30℃，环境湿度为70％。
18、优选的，所述步骤3)暗培养的条件包括：时间为1周，温度为30℃，环境湿度为70％。
19、优选的，所述步骤4)振荡暗培养的条件包括：转速为130rpm，温度为25～27℃，时间为1周。
20、优选的，所述步骤4)愈伤组织的质量与aa液体培养基的体积比为10g:50ml。
21、优选的，所述步骤5)振荡继代培养的条件包括：转速为130～150rpm，温度为25～27℃，时间为3～4个月。
22、优选的，所述步骤5)振荡继代培养的周期为3～5d，1个月后每10d振荡继代培养1次。
23、优选的，每次振荡继代培养周期更换四分之三体积的aa液体培养基。
24、本专利技术的有益效果为：
25、本专利技术提供的建立方法能高效诱导出水稻愈伤组织，通过设置光照培养和暗培养条件，以及特定振荡继代培养条件组合，能获得细胞团小、分散性好、均一性好且增长快的水稻悬浮细胞，并且在培养过程中未观察到愈伤组织及悬浮细胞的褐化情况。
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1.一种水稻悬浮细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤1)消毒的条件包括：将水稻种子去壳后，倒入体积百分含量为70％的乙醇溶液中消毒1～2min，倒去乙醇溶液，加入质量百分含量为30％的NaClO溶液，浸泡30min，倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4～5遍，最后一遍浸泡30min。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤1)诱导培养的条件包括：温度为29～31℃，时间为3～4周，光照强度在30000lx以上。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤2)继代培养的条件包括：先光照培养1周再暗培养1周；
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤3)暗培养的条件包括：时间为1周，温度为30℃，环境湿度为70％。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤4)振荡暗培养的条件包括：转速为130rpm，温度为25～27℃，时间为1周。
7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤4)
8.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤5)振荡继代培养的条件包括：转速为130～150rpm，温度为25～27℃，时间为3～4个月。
9.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤5)振荡继代培养的周期为3～5d，1个月后每10d振荡继代培养1次。
10.根据权利要求9所述的建立方法，其特征在于，每次振荡继代培养周期更换四分之三体积的AA液体培养基。
...【技术特征摘要】
1.一种水稻悬浮细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤1)消毒的条件包括：将水稻种子去壳后，倒入体积百分含量为70％的乙醇溶液中消毒1～2min，倒去乙醇溶液，加入质量百分含量为30％的naclo溶液，浸泡30min，倒去naclo溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4～5遍，最后一遍浸泡30min。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤1)诱导培养的条件包括：温度为29～31℃，时间为3～4周，光照强度在30000lx以上。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤2)继代培养的条件包括：先光照培养1周再暗培养1周；
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤3)暗培养的条件包括：时...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜锦林，张慧，谢宇峰，顾明月，王磊，龙涛，
申请(专利权)人：生态环境部南京环境科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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