【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基于靶向测序(tngs)的立克次体病病原体的引物组合及检测方法，该检测方法可以兼顾立克次体目5个属病原体和军团菌目贝纳柯克斯体属的检出，并将病原鉴定至种水平。
技术介绍
1、立克次体病主要指由立克次体目病原体感染引起的疾病。虽然，贝纳柯克斯体(coxiella burnetii)在最新的分类系统中被分到军团菌目，但其感染引起的q热仍然被归为立克次体病的范畴。蜱虫、螨虫、跳蚤、虱子等节肢动物是立克次体目病原体的主要传播媒介或贮存宿主，通过被感染的节肢动物叮咬人体后传播给人类，并引起立克次体病。临床上，立克次体病的症状主要包括发热、严重头痛、肌痛、特征性皮疹以及全身不适感，表现出从轻微的自限性发热到致命性败血症、呼吸衰竭、肾衰竭等一系列症状。
2、立克次体科(rickettsiaceae)的立克次体属(rickettsia)、无形体科(anaplasmataceae)的埃立克体属(ehrlichia)、无形体属(anaplasma)、新立克次体属(neorickettsia)、新埃立克体属(neoehrlichia)以及军团菌目(legionellanes)的贝纳柯克斯体(coxiella burnetii)是感染人类，并导致各类斑点热及斑疹伤寒、埃立克体病、无形体病、沙门体病、微小无形体病、q热的主要病原体；立克次体流行广、传播快，传播方式隐匿，感染后症状大多相似，但有些疾病如果未及时治疗，可能导致严重后果，如人单核细胞埃立克体病可能导致脑炎、洛杉矶斑点热可能致人死亡。早期诊断和治疗对于
3、目前，针对立克次体目病原体的临床实验室诊断主要有培养法、染色法、血清学诊断(外斐实验)、酶联免疫吸附试验以及基因诊断。虽然，分子方法(基因诊断)在诊断立克次体病中扮演着关键角色，尤其是在临床表现不典型或血清学检测结果不确定的情况下。基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)或实时荧光定量pcr(real-timequantitative pcr，qpcr)通过特异性扩增立克次体的dna片段来检测立克次体，即使在感染初期立克次体数量很少时也能进行检测，提高了早期诊断的准确率，有助于及时治疗，避免严重并发症。但是现有的检测方法其检测通量低，仅包含1-2种立克次体属的病原体；面对蜱虫、螨虫、跳蚤、虱子等节肢动物携带病原体的复杂性，现有检测方向显然无法满足需求。
4、此外，引起立克次体病的病原体复杂多样，每一个立克次体属由多个种的成员组成。现阶段，对于立克次体属各病原体的基因研究，物种鉴定的研究较少。仅有一些采用一代测序技术对少数几种立克次体病原体进行分种鉴定，而关于立克次体基因组序列二代测序的研究较少。sanger测序技术以其操作简单、测序片段长等优点被广泛应用。但同时，sanger法作为一代测序技术，其通量低、价格高、效率低、依赖于电泳分离技术，且只能检测20％～30％以上的准种，满足不了深度分析数据要求。
5、二代测序(next-generation sequencing，ngs)是检测和发现物种的新手段，过去10年间，已经有学者运用二代测序技术对节肢动物中的病原体进行监测。illumina测序平台是目前市面上应用最广泛的二代测序平台，因其测序错误率低，适用于扩增子测序、宏基因组测序和全基因组测序，应用领域广泛，具有通量高、用时短、经济、灵敏性好、准确率高等特点。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术提供了一种基于靶向测序(tngs)用于检测立克次体属(rickettsia)、埃立克体属(ehrlichia)、无形体属(anaplasma)、新立克次体属(neorickettsia)、新埃立克体属(neoehrlichia)和贝纳柯克斯(coxiella burnetii)的引物组合，并对这些属种的成员进行系统发育分析，物种鉴定至种水平；本专利技术对立克次体流行病学研究及临床早期分子诊断等具有重要意义。
2、所述用于扩增立克次体属分型区基因的特异性引物的核苷酸序列如seq id no:1-seq id no:51所示，扩增无形体属分型区基因的特异性引物的核苷酸序列如seq id no:52-seq id no:75所示，扩增埃立克体属、新埃立克体属分型区基因的特异性引物的核苷酸序列如seq id no:76-seq id no:86所示，扩增新立克次体属分型区基因的特异性引物的核苷酸序列如seq id no:87-seq id no:90所示，扩增贝纳柯克斯体的特异性引物的核苷酸序列如seq id no:91-seq id no:92所示。
3、本专利技术利用多重pcr技术对5个属和一个种的立克次体病病原体的分型区基因扩增，第一轮扩增所用引物的5’端加上了通用接头序列，第二步pcr所用引物与第一步通用接头序列部分重叠，且加上标签以区分不同的样本；两轮pcr扩增完成即完成了建库，等比混合文库，并在二代测序平台的基础上，采用miseq v2芯片对靶基因进行大规模的测序，一次可检测多个样本，具有简便、快速、准确和经济等特点，为不同属种立克次体病病原体的深度分析和临床早期诊断建立新的方法。
4、利用上述引物组合检测立克次体病病原体的方法如下：
5、(1)样品dna提取，所述样品为蜱虫或全血，蜱虫样本先用研磨仪研磨，研磨液用天根血液/组织/细胞基因组dna提取试剂盒提取；全血样本通过axygen试剂盒提取；
6、(2)以步骤(1)dna为模板，采用5个属和一个种的立克次体病病原体的引物组，引物组的核苷酸序列如seq id no:1-seq id no:92所示，扩增总共38个片段(部分片段有重叠区域)，每个样品的dna分6个反应体系进行多重pcr扩增(有重叠区域的引物分开，提前将同一反应体系中的引物混合)；将每个样品的6个pcr产物等比混合，混合产物进行1.1x磁珠纯化，去除多余的引物；
7、(3)以步骤(2)混合纯化后dna为模板，采用通用引物，通用引物核苷酸序列如seqid no:93-seq id no:94所示，进行第二轮pcr的扩增，获得一个样品的扩增产物；
8、在二代测序平台上，采用miseq v2芯片对靶基因进行大规模的测序，该方法具有通量高、成本低、灵敏性好、准确性高等特点，包括如下步骤：
9、a、将每个样品的第二轮pcr产物进行胶回收，去除反应液和杂质，得到纯化后产物；测定产物浓度；
10、b、测定浓度后，将不同样品的纯化产物进行等比混合，获得靶基因文库；
11、c、对靶基因文库进行磁珠纯化，去除残留的小片段，纯化后进行文库大小分析和定量，根据定量结果稀释文库并上机测序，最终分析获得样品中含有的立克次体病病原体。
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1.一种用于检测立克次体病病原体的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括针对立克次体属、埃立克体属、无形体属、新埃立克体属、新立克次体属、贝纳柯克斯体的特异性引物；
2.含有权利要求1所述的用于检测立克次体病病原体的引物组合的检测试剂盒。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测立克次体病病原体的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括针对立克次体属、埃立克体属、无形体属、新埃立克体属、新...
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