一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法技术

技术编号：41284289 阅读：5 留言：0更新日期：2024-05-11 09:33

本发明专利技术公开了一种从微生物菌落生物膜中分离和提取总DNA、胞内DNA和胞外DNA的方法，该方法属于生物学领域。该方法首先在固体培养基中培养生物膜，然后使用提取剂将生物膜中不同的部分收集起来，分别提取得到胞内DNA、胞外DNA和总DNA。该方法具有如下优点：一次得到3种不同的生物膜DNA组分，可对DNA各组分进行定量，具有高收率和高效率，操作过程简单易行，菌体裂解导致的交叉污染小，提取效果好。本发明专利技术解决了传统DNA提取技术在提取生物膜样品的DNA时无法区分不同DNA组分的问题，通过这种方法，能够全面了解生物膜中DNA各组分的信息，对于微生物生态学、环境科学和生物技术等方面的研究具有重要意义。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物领域，尤其涉及分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna组分的方法。

技术介绍

1、微生物在陆地生物地球化学循环和维持土壤肥力中起着关键作用。目前，微生物学家和生态学家等通常使用基于dna的方法以确定环境微生物群落的组成和多样性，但大多数情况是，直接从环境样本中提取总dna，忽略了胞外dna库的影响。已有研究表明胞外dna在环境中能够持续存在，会影响对基于dna的环境微生物群落多样性和结构的估计。自然环境中的大多数微生物是以生物膜的形式存在，生物膜基质中含有大量的胞外dna，然而，研究微生物群落层面的多样性和结构应仅包括样本中活的生物体，因此将生物膜中胞内dna和胞外dna进行分离和提取至关重要。另外，胞外dna主要来自于生物膜中死细胞的裂解释放和活细胞的主动分泌，在生物膜形成和水平基因转移等方面发挥着重要作用。因此，提取胞外dna也可以帮助我们了解微生物在环境中的分布、生态功能和遗传交流等方面的信息，对微生物群落结构、抗性基因、功能基因和物质循环等方面的研究具有重要意义。

技术实现思路

1、本专利技术旨在解决传统dna提取技术在提取生物膜样品的dna时无法区分不同dna组分的问题，提供一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna组分的方法。该方法首先在固体培养基中培养菌落生物膜，然后使用提取剂将生物膜中不同的部分收集起来，分别提取得到胞内dna、胞外dna和总dna，能够实现一次获得3种不同的生物膜dna组分，可对dna各组分进行定量，且具有高收率和高效率。

<p>2、本专利技术的技术方案如下：

3、本专利技术提供一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna组分的方法，包括如下步骤：

4、(1)在固体培养基上培养微生物菌落生物膜；在生物膜上加入提取剂刮取后得到生物膜悬液；使用带有广口吸头的移液器将生物膜悬液轻柔反复地吸打，形成均一的混悬液；将混悬液分为不等的3份，分别用于胞外dna、胞内dna和总dna的提取；

5、(2)将最多的混悬液离心后收集上清，所剩菌体沉淀重复加入提取剂重悬离心2～3次，同样收集上清，合并所有上清，用于胞外dna的提取；提取胞外dna时将上清液加入预冷的异丙醇进行处理，离心收集沉淀，用乙醇进行洗涤2次，然后使用商业dna纯化试剂盒纯化，得到胞外dna；

6、(3)将另一份混悬液离心弃去上清，使用适量dnase i反应缓冲液重悬，加入dnasei轻柔混匀，在适宜温度下反应一段时间，然后加入dnase i反应终止缓冲液，离心后弃去上清，保留菌体用于后续提取胞内dna；提取胞内dna时，在菌体中加入细胞裂解液和溶菌酶使细胞完全裂解，然后使用商业细菌基因组dna提取试剂盒提取，得到胞内dna；

7、(4)最后一份混悬液，加入细胞裂解液和溶菌酶反应完成后，使用商业细菌基因组dna提取试剂盒提取，得到总dna。

8、进一步地，所述的提取剂是由20 mm tris-hcl(ph 8.0)和2 mm edta组成，刮取时使用一次性无菌涂布棒轻轻地来回刮取。

9、进一步地，所述的混悬液分为不等的3份，其体积比为10:1:1。

10、进一步地，所述的离心条件为：离心温度为4℃，离心转速为6000～12000 rpm，离心时间为1～5 min。

11、进一步地，所述的异丙醇需提前预冷，异丙醇与上清液按照体积比为1:1的比例混合，孵育温度为-20℃，反应时间为30～40 min。

12、进一步地，所述的乙醇洗涤过程，乙醇的浓度为70％，且需加入乙醇后静置30～40s。

13、进一步地，所述的dnase i反应缓冲液由10 mm tris-hcl(ph 8.0)、2.5 mm mgcl2和0.5 mm cacl2组成。

14、进一步地，所述dnaseⅰ反应的条件为37℃水浴15 min，反应完成后需加入与dnasei相同体积的反应终止缓冲液，成分为edta，浓度为50 mm。

15、进一步地，所述细胞裂解液由是由10 mm tris-hcl(ph 7.6)、1 mm edta和1％sds组成，其反应条件为37℃水浴加热40～60 min，间隔涡旋的时间为20～30 min。

16、进一步地，所述溶菌酶溶液浓度为50 mg/ml。

17、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：

18、本专利技术首先培养微生物菌落生物膜，然后使用提取剂将生物膜中不同的部分收集起来，分别提取得到胞内dna、胞外dna和总dna。该方法能够一次得到3种不同的生物膜dna组分，可对dna各组分进行量化分析，且具有高收率和高效率。此外，该方法操作过程中菌体裂解导致的交叉污染小，也不会破坏dna分子片段影响结果测定，操作简单易行，提取效果好。本专利技术提供的方法将生物膜中3种dna组分进行分离并提取出来，解决了传统dna提取技术在提取生物膜样品的dna时无法区分不同dna组分的问题，通过这种方法，能够全面了解生物膜中dna各组分的信息，这对于微生物生态学、环境科学和生物技术等方面的研究具有重要意义。

19、加入提取剂使生物膜重悬，不仅可以维持核酸的稳定性，而且对菌体细胞有保护作用，防止细胞裂解造成胞内dna污染胞外dna。在4℃条件下离心，可以减少酶的活性和dna的降解，保护dna的完整性和提高提取的dna质量。加入细胞裂解液和溶菌酶，能够破坏或分解细菌细胞壁，从而提高胞内dna的提取效率。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，所述的提取剂是由20mM Tris-HCl(pH 8.0)和2mM EDTA组成，刮取时使用一次性无菌涂布棒轻轻地来回刮取。

3.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，将混悬液分为不等的3份，其体积比通常为10:1:1。

4.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，所述的离心条件为：离心温度为4℃，离心转速为6000～12000rpm，离心时间为1～5min。

5.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，所加入的异丙醇需提前预冷，异丙醇与上清液按照体积比为1:1的比例混合，孵育温度为-20℃，反应时间为30～40min。

6.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，

7.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，所述的DNase I反应缓冲液由10mM Tris-HCl(pH 7.6)、2.5mM MgCl2和0.5mMCaCl2组成。

8.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，DNase I反应的条件为37℃水浴15min，反应完成后需加入与DNase I相同体积的反应终止缓冲液，成分为EDTA，浓度为50mM。

9.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，所述细胞裂解液由10mM Tris-HCl、1mM EDTA和1％SDS组成，其反应条件为37℃水浴加热40～60min，间隔涡旋的时间为20～30min。

10.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种DNA组分的方法，其特征在于，所述溶菌酶溶液浓度为50mg/mL。

...

【技术特征摘要】

1.一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna组分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna组分的方法，其特征在于，所述的提取剂是由20mm tris-hcl(ph 8.0)和2mm edta组成，刮取时使用一次性无菌涂布棒轻轻地来回刮取。

3.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna组分的方法，其特征在于，将混悬液分为不等的3份，其体积比通常为10:1:1。

4.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna组分的方法，其特征在于，所述的离心条件为：离心温度为4℃，离心转速为6000～12000rpm，离心时间为1～5min。

5.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna组分的方法，其特征在于，所加入的异丙醇需提前预冷，异丙醇与上清液按照体积比为1:1的比例混合，孵育温度为-20℃，反应时间为30～40min。

6.根据权利要求1所述的一种分离与提取微生物菌落生物膜中3种dna...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡鹏，高春辉，张玺民，朱韵林，吴一超，黄巧云，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人