【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原微生物检测，具体涉及一种基于raa-crispr/cas12a的牛溶血性曼氏杆菌的可视化检测方法及试剂盒。
技术介绍
1、溶血性曼氏杆菌(mannheimia haemolytica，m.h)属于巴氏杆菌科曼氏杆菌属，是牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease，brd)的主要细菌病原。m.h常存在于健康反刍动物上呼吸道的鼻腔和扁桃体中，当动物因病毒感染、运输及断奶等应激因素导致免疫受损时，该病原菌从良性共生菌转变为致病性病原菌，导致动物发生纤维性肺炎、支气管肺炎及胸膜炎等症状，给全球牛羊养殖业造成巨大经济损失。因此建立一种快速、灵敏和便携的检测方法对于流行病学调查分析以及对于牛m.h的防控具有重要价值。
2、传统的病原分离鉴定方法培养缓慢，耗时长，并且由于动物体内的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、海藻巴氏杆菌等多种细菌均能抑制m.h的生长，所以临床难以分离m.h，不适用于即时检测。张培君等(2003)针对m.h所建立的pcr检测方法，虽然菌液检测敏感性高达8×102cfu/ml，但需要热循环仪器和专业操作人员，不适合基层检测。李富祥等(2016)针对16srna的保守序列所建立的taqman荧光定量pcr检测方法，质粒检测敏感性为3.06×101copies/μl，虽然该方法的敏感性较高，但是仪器及试剂昂贵，并且操作繁琐，很难在牛场中普及应用。dao等(2022)针对soda基因开发了一种恒温热隔绝式pcr方法，该方法根据rayleigh-benard对流原理进行扩增，虽然质粒灵
3、重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification,raa)是一种由重组酶、单链结合蛋白及bsu dna聚合酶等组成的恒温检测方法。原理是重组酶、单链结合蛋白与特异性dna引物结合识别靶标dna并使其解旋，在dna聚合酶作用下完成链的延伸以及指数级扩增，与其他检测方法相比，该方法无需热循环仪器以及专业的人员，在37℃下30min即可完成反应。但raa方法特异性稍差，容易造成假阳性。
4、成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/crispr associated proteins，简称crispr/cas)是一种原核生物的免疫防御系统，具有独特的靶点识别能力，并显现出对dna双链及单链的切割能力。在该系统中，sgrna引导cas12a识别靶标，并形成三元复合物。然后激活cas12a的“反式切割”活性，非特异性切割体系中的游离单链dna(single-stranded dna，ssdna)，使ssdna两端的荧光基团和淬灭基团分离，从而产生大量荧光信号，借助紫外光或蓝光切胶仪可以观察到荧光。由于crispr/cas12a体系有特异性识别靶序列的能力，与raa等温扩增法结合可以提高raa方法的特异性；通过raa等温扩增法将靶序列进行指数级扩增，增强了crispr/cas12a体系的检测灵敏度。目前，基于raa-crispr/cas12a检测系统已开发了多种病原菌的检测，但未见该系统应用于牛m.h的检测，因此，建立raa与crispr/cas12a检测体系相结合的检测牛m.h的方法，具有重要临床应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是构建一种牛m.h的检测试剂盒和方法，基于牛m.h的lptb基因(编码脂多糖运输蛋白)保守区设计引物，结合crispr/cas12a系统以实现牛m.h的灵敏、特异且快速可视化检测。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、一种牛溶血性曼氏杆菌快速可视化检测试剂盒，所述试剂盒中包括：
4、(1)根据核苷酸序列如seq id no:3所示的基因片段设计的引物，该引物用于扩增牛溶血性曼氏杆菌lptb基因目的片段；
5、(2)根据牛溶血性曼氏杆菌lptb基因目的片段设计的sgrna，用于引导cas12a蛋白识别靶标分子；
6、(3)用于切割单链dna的cas12a蛋白；
7、(4)含有可检测标记物和淬灭剂的ssdna报告分子。
8、其中，所述引物为重组酶介导等温核酸扩增(raa)引物，正向引物序列如seq idno:15、反向引物序列如seq id no:16所示。针对seq id no:3所示的基因片段还能设计出其它raa引物，例如说明书具体实施例中记载的序列如seq id no:17、seq id no:18所示的引物，本专利技术优选的引物相较其它raa引物具有更高的检测灵敏度。
9、说明书具体实施例1中还记载了一种普通pcr引物，该引物同样也能扩增出m.h的lptb基因目的片段，扩增产物完全覆盖了raa引物，且raa扩增产物仅存在32bp的缺失，因此该普通pcr引物同样也能用于本专利技术的后续检测，但是相较普通pcr引物，本专利技术优选的raa引物能在37℃下30min完成反应，从而大幅度提高了扩增效率。
10、除了本专利技术说明书中已记载的两种引物，其它根据seq id no:3所设计的引物例如lamp引物、rpa引物等也都在本专利技术的保护范围内。
11、其中，所述sgrna的序列为auuucuacuguuguagaucacacggcggcguucacca c，该sgrna是申请人从多条sgrna中筛选比较得出，它具有更强的活性，所引导的cas12a蛋白切割产物能产生更强的荧光，因此能提高检测灵敏度。
12、其中，所述的cas12a蛋白和ssdna报告分子都为本领域常规序列，可参考文献例如cn 113308577 a专利文献获得。
13、本专利技术提供的试剂盒还包括样品基因组dna提取试剂、反应液等。
14、本专利技术进一步提供一种牛溶血性曼氏杆菌快速可视化检测方法，包括以下步骤：
15、(1)提取样品基因组dna并根据核苷酸序列如seq i本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica，M.h)快速可视化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
2.如权利要求1所述的牛溶血性曼氏杆菌快速可视化检测试剂盒，其特征在于：所述引物为重组酶介导等温核酸扩增(RAA)引物，所述RAA引物的序列如SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16所示。
3.如权利要求1所述的牛溶血性曼氏杆菌快速可视化检测试剂盒，其特征在于：所述sgRNA的序列为AUUUCUACUGUUGUAGAUCACACGGCGGCGUUCACCAC。
4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在牛溶血性曼氏杆菌非诊断目的检测中的应用。
5.一种牛溶血性曼氏杆菌非诊断目的快速可视化检测方法，其特征在于包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述引物为重组酶介导等温核酸扩增(RAA)引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述sgRNA的序列为AUUUCUACUGUU
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述扩增反应条件为：29.4μL ABuffer，2μL RAA正向引物，2μL RAA反向引物，2μL DNA模板，2.5μL B Buffer，12.1μL DEPC水，37℃反应30min。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a反应条件为：200nMCas12a蛋白，200nM sgRNA，800nM ssDNA，2μL Buffer2.1，3μL扩增产物，DEPC水补齐至20μL，37℃反应15min。
...【技术特征摘要】
1.一种牛溶血性曼氏杆菌(mannheimia haemolytica，m.h)快速可视化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
2.如权利要求1所述的牛溶血性曼氏杆菌快速可视化检测试剂盒，其特征在于：所述引物为重组酶介导等温核酸扩增(raa)引物，所述raa引物的序列如seq id no:15、seq idno:16所示。
3.如权利要求1所述的牛溶血性曼氏杆菌快速可视化检测试剂盒，其特征在于：所述sgrna的序列为auuucuacuguuguagaucacacggcggcguucaccac。
4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在牛溶血性曼氏杆菌非诊断目的检测中的应用。
5.一种牛溶血性曼氏杆菌非诊断目的快速可视化检测方法，其特征在于包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述引物为重组酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，郭爱珍，赵梦莹，姜传文，于凡淞，陈颖钰，胡长敏，陈建国，张磊，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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