本发明专利技术属于分子遗传学领域，尤其涉及与菠菜草酸含量相关的KASP分子标记开发及其应用。利用全基因组关联分析(GWAS)发掘与菠菜草酸含量相关联的SNPs，并将其开发为KASP分子标记，辅助育种。GWAS已被广泛用于玉米、水稻和菜豆等其他作物的数量性状相关基因的鉴定中，而且在菠菜中已经利用GWAS鉴定了许多与抗病性、性别、株型和耐抽薹性等性状有关的标记或基因。利用本发明专利技术提供的三条KASP引物可以在苗期对菠菜草酸含量特性进行检测，其分析通量高，准确率高。本发明专利技术提供的共显性KASP标记有利于筛选低草酸含量的菠菜品种，缩短了低草酸含量菠菜品种的选育时间。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子遗传学，尤其涉及与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用。
技术介绍
1、菠菜(spinacia oleracea l.,2n＝2x＝12))属苋科藜亚科菠菜属植物，原产伊朗，是主要以绿叶为产品器官的一、二年生草本植物。因其适应性广、耐储藏、供应期长、栽培方式多样，营养比较全面，在世界各地普遍种植。
2、菠菜富含营养物质和促进健康的化合物，如维生素、矿质元素等，被认为是人类饮食中最健康的蔬菜之一。但菠菜中也含有一些负营养物质，如草酸。草酸在植物中主要分为两种形式，可溶性草酸和难溶性草酸，其中可溶性草酸是菠菜中草酸盐的主要存在形式。当被消化道吸收时，草酸易与钙离子、镁离子等金属离子发生螯合，形成不易溶解的草酸盐，从而通过减少矿物质的吸收和促进肾结石的形成对人体健康造成负面影响。研究发现不同菠菜材料中的草酸含量变异丰富，草酸调控网络较为复杂，可能是由多个基因控制的。乙醛酸/乙醇酸、抗坏血酸和草酰乙酸被认为是多种植物中草酸合成的前体，乙醛酸/乙醇酸经过乙醇酸氧化酶(glo)催化，氧化为草酸；草酰乙酸经草酸乙酸乙酰水解酶(oxac)催化形成草酸；抗坏血酸通过c2/c3裂解形成草酸。草酸还通过三种途径被降解：氧化、脱羧和乙酰化，草酸氧化酶将草酸氧化为h2o2和co2；草酸脱羧酶催化草酸降解为甲酸和co2；草酰辅酶a合酶、草酰辅酶a脱羧酶、甲酰辅酶a水解酶和甲酸脱氢酶共同作用使草酸降解为co2。
3、现有研究尚未开发与菠菜草酸含量相关的分子标记，不利于菠菜低草酸品种的选育。
技术实现思路
1、本专利技术提供与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记开发及其应用，用于选育理想的低草酸含量菠菜品种。
2、本专利技术提供一种与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，染色体sovchr1第50807332位的碱基为g或t；
3、优选的，碱基为g的菠菜植株为低草酸含量植株；
4、和/或，碱基为t的菠菜植株为高草酸含量植株。本专利技术标记kmox06位于菠菜1号染色体上，物理位置为50807332bp，snp位点处碱基为g/t，碱基为g的菠菜植株为低草酸含量植株，碱基为t的菠菜植株为高草酸含量植株。本专利技术提供的与菠菜草酸含量相关的kasp分子标记kmox06，可以用于选育低草酸含量的优质菠菜品种，缩短育种年限。
5、根据所述的与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，该snp分子标记的位置是根据菠菜全基因组序列而确定的，网址为http://spinachbase.org/ftp/genome/monoe-viroflay/。
6、本专利技术还提供一种引物组合，用于扩增所述分子标记；
7、优选的，包括第一引物、第二引物和第三引物；
8、所述第一引物的的核苷酸序列如seq id no.1(aaccaacgggggaagatattgc)所示；
9、所述第二引物的的核苷酸序列如seq id no.2(gaaccaacgggggaagatattga)所示；
10、所述第三引物的的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11、本专利技术还提供一种kasp引物组合，包括第一引物、第二引物和第三引物；
12、所述第一引物为中第一引物的5’端加上a荧光对应的标签序列a；
13、所述第二引物为第二引物的5’端加上b荧光对应的标签序列b；
14、所述a荧光与b荧光不同；
15、优选的，所述第一引物的的核苷酸序列如seq id no.4所示；
16、所述第二引物的的核苷酸序列如seq id no.5所示。
17、优选的，本专利技术所述的kasp标记共包含3条序列，其中两条为正向引物，一条为通用的反向引物，如下显示：
18、(1)正向引物1：5’-gaaggtgaccaagttcatgctaaccaacgggggaagatattgc-3’(seq idno.4)；其中gaaggtgaccaagttcatgct为通用标签a；
19、(2)正向引物2：5’-gaaggtcggagtcaacggattgaaccaacgggggaagatattga-3’(seqid no.5)；其中gaaggtcggagtcaacggatt为通用标签b；
20、(3)反向引物：5’-ccttgttaaggcgtagcctaaacag-3’(seq id no.3)。
21、本专利技术还提供含有所述引物组合的产品，所述产品为检测试剂或试剂盒。
22、本专利技术还提供一种鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，以待检测的菠菜dna为模版，利用所述引物组合，根据引物扩增结果判断菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型；
23、优选的，根据荧光检测结果判断。
24、根据所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，包括以下步骤：
25、(1)提取待检测的菠菜dna；
26、(2)稀释步骤(1)中的dna到20ng/μl，并向其中加入特异的kasp primer mix；
27、(3)加入通用的kasp master mix，进行pcr扩增；pcr产物在低于40℃下进行荧光检测分析；仅检测到通用标签a荧光，为gg基因型，对应的是菠菜中草酸含量较低；仅检测到通用标签b荧光，为tt基因型，对应的是菠菜中草酸含量较高；如果同时检测到通用标签a和b荧光，为gt基因型，则对应的是菠菜中草酸含量处于中间水平。
28、上述特异的kasp primer mix含所述的引物组合；
29、优选的，上述通用的kasp master mix包含如下组份：通用的tret cassette荧光引物，rox内参染料，kleartaq dna聚合酶，dntp和mgcl2。
30、优选的，所述kasp primer mix含有3条特异引物：分别带有通用标签a和b的正向引物1和2，以及一条反向引物。
31、优选的，所述kasp master mix包含通用的fret cassette荧光引物，rox内参染料，klear taq dna聚合酶，dntp和mgcl2等组分，已预置于优化的缓冲液中。其中荧光报告基团a为fam，荧光报告基团b为hex，所述kasp master mix是英国lgc公司产品。产品目录号为kbs-1016-002。
32、根据所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，每10μl反应体系包括4.86模板dna、5μlkasp master mix和0.14μlkasp primer mix；
33、优选的，该反应体系适用于96孔板或384孔板。
34、优选的，所述反应体系为：
35、
36、
37、根据所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，pcr反应条件包括如下步骤本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，其特征在于，染色体SOVchr1第50807332位的碱基为G或T；
2.根据权利要求1所述的与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，其特征在于，该SNP分子标记的位置是根据菠菜全基因组序列而确定的，网址为http://spinachbase.org/ftp/genome/Monoe-Viroflay/。
3.一种引物组合，其特征在于，用于扩增权利要求1或2所述分子标记；
4.一种KASP引物组合，其特征在于，包括第一引物、第二引物和第三引物；
5.含有权利要求3或4所述引物组合的产品，其特征在于，所述产品为检测试剂或试剂盒。
6.一种鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，其特征在于，以待检测的菠菜DNA为模版，利用权利要求3或4所述引物组合，根据引物扩增结果判断菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型；
7.根据权利要求6所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求6或7所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，其特征在于，每10μl反应体系包括4.86模板DNA、5μlKASP Master mix和0.14μlKASP Primer mix；
9.根据权利要求6或7所述鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法，其特征在于，PCR反应条件包括如下步骤：
10.权利要求3或4所述引物组合或权利要求5所述产品在以下任一项或几项中的应用：
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【技术特征摘要】
1.一种与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，其特征在于，染色体sovchr1第50807332位的碱基为g或t；
2.根据权利要求1所述的与菠菜草酸含量性状相关的分子标记，其特征在于，该snp分子标记的位置是根据菠菜全基因组序列而确定的，网址为http://spinachbase.org/ftp/genome/monoe-viroflay/。
3.一种引物组合，其特征在于，用于扩增权利要求1或2所述分子标记；
4.一种kasp引物组合，其特征在于，包括第一引物、第二引物和第三引物；
5.含有权利要求3或4所述引物组合的产品，其特征在于，所述产品为检测试剂或试剂盒。
6.一种鉴定菠菜草酸含量和/或草酸含量基因分型的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘志远，张合龙，钱伟，折红兵，徐兆生，纪妮，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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