【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因治疗，更具体的说是涉及一种共价交联的锤头核酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、核酶可以根据不同的rna结构催化多种化学反应，这些反应包括但不限于磷酸二酯键的断裂和连接，以及核碱基的烷基化等。与其他催化rna系统相比，rna切割的核酶最受关注，这不仅是因为它在生物系统中广泛存在，而且还因为它有潜力发展成为强大的rna干扰(rnai)工具来实现基因操控。自rna切割的核酶被发现以来，基于核酶工程技术的基因沉默方法的研究得到了广泛的应用。在这些rna切割核酶中，锤头核酶(hammerheadribozyme,hhr)是表征最好、体积最小的核酶。通过将天然的自切割的hhr工程化改造成反式切割，使得修饰后的hhr可以作为指定的rna底物切割的通用工具，是最有希望发挥rnai功能的核酶工具。
2、然而，尽管在核酶工程方面进行了广泛的研究，特别是在过去的几十年里对hhr的操纵进行了广泛的研究，但反式切割核酶在细胞环境中的低效率仍然阻碍了它们在rna干扰方面的实际应用，使其严重落后于其它基于rna的系统，如目前广泛应用的sirna和crispr技术。事实上，基于核酶的rna操纵工具可以仅依靠rna自身发挥作用，而无需招募内源性(sirna)或外源性(crispr)蛋白，这是它的一个巨大优势，因为它对细胞稳态的干扰最小。目前面临地最大的挑战将是如何产生一种高效的rna反式切割核酶，而不影响对不同底物的通用性。对于广泛研究的hhr，结构研究表明，远离催化域的远端loop-loop相互作用(stem i的loop和st
3、因此，提供一种共价交联的锤头核酶及其制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种共价交联的锤头核酶及其制备方法和应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种共价交联的锤头核酶，其结构示意图如iii-3所示：
4、
5、式中：
6、共价连接基团中碳链长度n为2、6或10。
7、进一步，一种共价交联的锤头核酶，与底物rna靶向作用的结构如通式i所示：
8、
9、式中：
10、共价连接基团中碳链长度n为2、6或10；
11、stem i与rna底物的配对的长度为6bp；
12、stem iii与rna底物的配对长度为6～12bp；
13、stem ii的loop环为4～6nt；
14、共价交联的锤头核酶与底物rna识别遵守“nux”规则，其中“n”是a、u、c、g中的任意一个，“x”代表a、c或u，并且切割发生在x的3'-磷酸二酯键处。
15、进一步，所述的一种共价交联的锤头核酶的制备方法，包括以下步骤：
16、(1)亚磷酰胺骨架单体ii-1的制备：以3-氨基-1,2-丙二醇为起始原料，经过dmtr保护、与三氟乙酸乙酯缩合，后者再与亚磷酸试剂反应得亚磷酰胺单体ii-1；
17、
18、(2)亚磷酰胺炔基单体ii-2的制备：以不同碳链长度的炔基醇为起始原料，与亚磷酸试剂反应得亚磷酰胺单体ii-2；
19、
20、(3)锤头核酶中间体iii-1(unclicked hhr-nh2)的制备：以亚磷酰胺骨架单体ii-1、亚磷酰胺炔基单体ii-2、ra、rg、rc、ru为构建单元，通过传统的亚磷酰胺固相合成法，使用核酸固相合成仪将亚磷酰胺骨架单体ii-1和亚磷酰胺炔基单体ii-2引入hhr核酸链中，通过标准rna合成程序制备得到锤头核酶中间体iii-1(unclicked hhr-nh2)；
21、
22、(4)锤头核酶中间体iii-2(unclicked hhr-n3)的制备：将得到的锤头核酶中间体iii-1(unclicked hhr-nh2)与叠氮乙酸nhs酯缩合得到含有叠氮基团的锤头核酶中间体iii-2(unclicked hhr-n3)；
23、
24、(5)共价交联的锤头核酶iii-3(crosslinked hhr)的制备：将得到的含有叠氮基团修饰的锤头核酶中间体iii-2(unclicked hhr-n3)，经cu(i)催化交联环化得到共价交联的锤头核酶iii-3(crosslinked hhr)；
25、
26、进一步，所述的一种共价交联的锤头核酶的制备方法，
27、步骤(1)中，所述dmtr保护反应中所用溶剂为吡啶；与亚磷酸试剂反应所用碱为n,n-二异丙基乙胺；亚磷酸试剂为2-氰基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺；
28、步骤(2)中，亚磷酸试剂为2-氰基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺；
29、步骤(3)中，hhr核酸链的合成是通过核酸固相合成仪合成的；经固相合成的核酸链的后处理是用22％的氨水溶液将rna产物从cpg中切割出来，并在55℃下孵育12小时；再经乙醇沉淀后，将rna寡核苷酸溶解在无水dmso和tea·3hf的混合溶液中，并在65℃下加热2.5小时；再次乙醇沉淀后，使用plrp-s柱通过高效液相色谱纯化粗rna，得到锤头核酶中间体iii-1；
30、步骤(4)中，锤头核酶中间体iii-1与叠氮乙酸nhs酯的缩合是在250mm、ph 9.0的nahco3缓冲液中进行的；
31、步骤(5)中，锤头核酶的5’端被分别共价交联到stem ii的loop环的4个不同位置；共价交联的碳链长度分别为2、6、10。
32、进一步，所述的一种共价交联的锤头核酶在rna切割中的应用。
33、进一步，所述的一种共价交联的锤头核酶在基因调控中的应用。
34、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种共价交联的锤头核酶及其制备方法和应用，通过化学共价交联minimal hhr的5’端和stem ii的loop环的策略来取代full-length本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种共价交联的锤头核酶，其特征在于，其结构示意图如III-3所示：
2.一种共价交联的锤头核酶，其特征在于，与底物RNA靶向作用的结构如通式I所示：
3.根据权利要求1或2所述的一种共价交联的锤头核酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种共价交联的锤头核酶的制备方法，其特征在于，
5.权利要求1或2所述的一种共价交联的锤头核酶在RNA切割中的应用。
6.权利要求1或2所述的一种共价交联的锤头核酶在基因调控中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种共价交联的锤头核酶，其特征在于，其结构示意图如iii-3所示：
2.一种共价交联的锤头核酶，其特征在于，与底物rna靶向作用的结构如通式i所示：
3.根据权利要求1或2所述的一种共价交联的锤头核酶的制备方法，其特征在于，包括...
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