【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中分布的方法。
技术介绍
1、百合是百合科百合属多年生鳞茎类球根花卉，其花型花色多样，具有极高的观赏、食用和药用价值，被誉为“球根花卉之王”。生产中，百合主要以种球或鳞片扦插等无性繁殖为主，长期无性繁殖致使卷丹种球病毒积累严重，种性退化，产量和质量大大降低，严重制约了百合产业的发展。
2、目前，较确定的百合病毒有19种，其中在我国发生普遍、危害严重的病毒主要有3种，即百合无症病毒(lily symptomless virus，lsv)、百合斑驳病毒(lily mosaic virus，lmov)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosais virus，cmv)。随着对百合种球进口数量的增加，先后从荷兰等国进口的百合中检测出多种新病毒，使我国种植业存在巨大风险。病毒病在防治上十分困难，目前还没有好的药剂能够治好，因此，百合脱毒培养成为解决此问题的根本办法。
3、国内外学者先后对百合进行了脱毒研究，主要脱毒技术有离体茎尖培养脱毒、热疗法脱毒、化疗脱毒、超低温脱毒和转基因脱毒，其中离体茎尖培养脱毒技术最为主要。关于百合茎尖脱毒研究主要集中在以下几个方面：①不同茎尖大小培养后的存活率、再生率和脱毒率；②剥取茎尖前热处理植株或鳞茎，以切取不同大小茎尖来分析热处理对茎尖无毒区域扩增的影响；③剥取茎尖启动培养时加入不同病毒抑制剂以抑制茎尖中病毒的增殖或移动来剥取较大的茎尖；④连续多次剥取较大的茎尖培养，以稀释毒株中病毒含量；⑤超低温处理后剥取不同大
技术实现思路
1、基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中分布的方法，以解决
技术介绍
中提出的问题。
2、为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、提供一种荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中分布的方法，其包括以下步骤：
4、步骤1、设计与合成探针：
5、基于百合无症病毒基因组序列设计探针，探针序列为：5′-gcgttgtgggctatgacctcagcagaagtgg-3′，通过6-羧基荧光素和探针核苷酸结合，形成有荧光标签的标记探针；
6、步骤2、固定茎尖与制片；
7、步骤3、原位杂交：
8、切片经脱腊复水后滴加蛋白酶k消化；纯水冲洗后pbs洗多次，滴加适量预杂交液孵育，之后倾去预杂交液，滴加含探针的杂交液，杂交过夜；洗去杂交液，ssc洗；切片滴加dapi染液，避光孵育，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片；切片于荧光显微镜下观察并采集图像，dapi染出来的细胞核在紫外激发下为蓝色，病毒序列表达为6-羧基荧光素标记的绿光。
9、进一步地，步骤2的方法具体为：
10、(1)体式显微镜下剥取约5mm×5mm×2mm的茎尖置于1.5ml无rna酶的预冷faa固定液中，真空泵抽真空15min，换新的固定液于4℃固定12h以上；
11、(2)茎尖样本在冰浴条件下经梯度酒精和二甲苯进行脱水、透明，浸蜡3d后进行石蜡包埋；
12、(3)用旋转切片机进行切片，切片厚度为8um。
13、进一步地，步骤3方法具体为：
14、切片经脱腊复水后滴加20μg/ml蛋白酶k，37℃消化15min；纯水冲洗后pbs洗3次，每次5min；滴加适量预杂交液，37℃孵育1h，之后倾去预杂交液，滴加含探针的杂交液，40℃杂交过夜；洗去杂交液，2×ssc37℃洗10min，1×ssc37℃洗10min，0.5×ssc室温洗10min；切片滴加dapi染液，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片；切片于徕卡正置荧光显微镜下观察并采集图像，dapi染出来的细胞核在紫外激发下为蓝色，病毒序列表达为6-羧基荧光素标记的绿光。
15、本专利技术的有益效果为：
16、本专利技术提出了一种荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中分布的方法，能够得到百合无症病毒在茎尖中的分布情况，为百合脱毒培养提供支撑。
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1.一种荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中分布的方法，其特征在于，步骤2的方法具体为：
3.根据权利要求1所述的荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中分布的方法，其特征在于，步骤3方法具体为：
【技术特征摘要】
1.一种荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的荧光原位杂交检测百合无症病毒在百合茎尖中...
【专利技术属性】
技术研发人员：明军，杨盼盼，徐雷锋，许雪飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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