【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及毒理学和分子生物学领域，具体涉及mir-8545抑制剂在制备小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性治理药物中的应用。
技术介绍
1、小菜蛾plutella xylostella(l.)，属于鳞翅目(lepidoptera)菜蛾科(plutellidae)，是一种世界性的十字花科蔬菜害虫，寄主植物高达40种以上，严重制约十字花科蔬菜生产。小菜蛾整个发育可以分为4个阶段(卵期、幼虫期、蛹期和成虫期)，其中以幼虫期危害植物叶片，严重时导致植物只留下残存的主脉，大大降低蔬菜的产量和质量，造成重大的经济损失。据报道，全世界每年因小菜蛾造成的经济损失高达40-50亿美元，在我国因小菜蛾造成的经济损失高达7.7亿美元。小菜蛾为害如此严重的原因是因其极易对多种化学杀虫剂产生抗药性。据报道，目前小菜蛾几乎对所有化学杀虫剂产生了不同程度的抗药性，使得田间化学防治小菜蛾变得艰难，因此寻找新的防治方法变得尤为重要。
2、苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis,bt)是一种在形成芽胞阶段能产生多种杀虫晶体蛋白的革兰氏阳性杆状细菌，产生的晶体蛋白能够高效且单一的杀死不同靶标害虫。此外，由于具有杀虫谱广、高效专一且对人畜环境无害等特性，bt成为世界上用量最大的微生物杀虫剂。同时，多种bt杀虫蛋白基因已被成功克隆并转入到多种重要的经济作物中用于防治害虫，种植面积已经超过1.9亿公顷。然而，bt的大量和不合理应用已经导致13种害虫在田间对bt制剂或bt作物产生抗性，严重影响bt生物杀虫剂和转bt作物的推广和使用。小菜蛾
3、microrna(mirna)是一类长度约为18-24个核苷酸的内源非编码单链rna分子，能够与靶基因的特定位点结合(称为“种子”区)引导信使rna (mrna)降解或翻译抑制。在人类中，超过2500个成熟的mirnas在mirbase数据库中被登录，大约60％的基因受到mirna的调控。在昆虫中，越来越多的研究表明mirna参与调控昆虫的变态发育，生殖，神经变性和抗药性等生物学功能。此外，mirna是表观遗传调控通路的关键因子，能够及时响应外界刺激并调控下游基因的表达。目前，mirna已经参与生命体多种重要的生理病理过程，包括生长发育、细胞增殖分化与免疫活动的调节以及昆虫杀虫剂抗药性等生命活动。
4、昆虫对杀虫剂产生抗药性以后，体内的mirna表达水平发生显著的变化，通过调节昆虫体内相关抗性基因的表达量变化，因此介导昆虫对杀虫剂产生抗性。目前，体外化学合成mirna的激动剂和抑制剂是一种重要的方式用于研究差异表达mirna在昆虫杀虫剂抗性中的作用。同时，mirna的激动剂和抑制剂的生产费用也在逐年降低，因此显著降低了应用的成本。毫无疑问，化学合成功能性mirna激动剂或抑制剂已经成为一种用于控制和延缓昆虫杀虫剂抗性的一种重要手段。因此，在小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac的抗性治理过程中，开发一种有效的功能性mirna激动剂或抑制剂用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性尤为迫切，为此我们开展了该研究。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性治理过程中药剂缺乏的问题，通过化学合成特异性mirna激动剂和抑制剂，制备一种特异、安全、绿色和高效的小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性治理药剂。
2、根据本专利技术人实验室对bt杀虫蛋白cry1ac敏感和抗性种群中肠转录组和rt-qpcr检测分析发现，mir-8545基因表达量在4个小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性种群中表达量显著升高。基于这一结果，专利技术人设计并利用化学合成mir-8545的激动剂和抑制剂，其中mir-8545激动剂(mimic)核酸序列如seq id no:4所示，mir-8545抑制剂(inhibitor)核酸序列如seq id no:5所示。
3、在此基础之上，研究mir-8545与小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的关系。研究结果发现，将上述mir-8545激动剂显微注射到小菜蛾3龄期幼虫血淋巴中显著增加mir-8545的表达量，72h后的毒力生物测定结果显示mir-8545激动剂注射显著降低幼虫的死亡率。将mir-8545抑制剂显微注射到小菜蛾3龄期幼虫血淋巴中显著降低mir-8545的表达量，72h后的毒力生物测定结果显示mir-8545抑制剂显微注射显著增加幼虫的死亡率。结果说明合成mir-8545抑制剂可以用于制备治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的药剂。
4、在基于mir-8545抑制剂制备小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性治理药剂的专利技术中，本专利技术以mir-8545的20个核苷酸序列为基础，设计特异性的反义互补非编码rna序列，该序列更够特异性的靶向小菜蛾体内的mir-8545序列，以此消耗小菜蛾体内的mir-8545序列，降低mir-8545的表达量来减缓小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac产生抗性，该方法具有特异、安全、绿色和高效的特点，由此提出本专利技术。
5、本专利技术提供的技术方案是：一种用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂，所述用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂为减少mirna的表达水平。
6、进一步地，所述mirna抑制剂包含一段由mir-8545序列的反义互补非编码rna序列；优选地，所述反义互补非编码rna序列的长度为18-24个碱基，更优选为20个碱基。
7、所述的mirna抑制剂，优选地，所述反义互补非编码rna序列的核酸序列如seq idno:5所示。
8、同时，本专利技术还提供所述的用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂在制备小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性治理的药剂中的应用。
9、所述的应用，进一步地，通过将所述用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂施于种植场所或田间，或喷施到小菜蛾体表来实现。
10、本专利技术还提供一种制备对bt杀虫蛋白cry1ac敏感的小菜蛾的方法，该方法是将所述用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂注射到小菜蛾体内而得到。
11、本专利技术还提供一种防治辅助防治小菜蛾的方法，该方法是在种植场所或田间施用bt杀虫蛋白cry1ac的防治小菜蛾的同时，施用所述用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂。
12、具有如下优点及效果：
13、本专利技术用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂可以降低小菜蛾中mir-8545的表达量，提高小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac的敏感性，以此降本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂，其特征在于，所述用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂为减少miRNA的表达水平。
2.如权利要求1所述的用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂，其特征在于，所述用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂包含一段由miR-8545序列的反义互补非编码RNA序列。
3.如权利要求2所述的用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂，其特征在于，所述反义互补非编码RNA序列的长度为18-24个碱基，优选为20个碱基。
4.如权利要求3所述的用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂，其特征在于，所述反义互补非编码RNA序列的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.如权利要求1至 4任一项所述的用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂在制备小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性治理的药剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，通过
7.一种制备对Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感的小菜蛾的方法，其特征在于，将所述用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂注射到小菜蛾体内而得到。
8.一种辅助防治小菜蛾的方法，其特征在于，在种植场所或田间施用Bt杀虫蛋白Cry1Ac的防治小菜蛾的同时，施用所述用于治理小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的miRNA抑制剂。
...【技术特征摘要】
1.一种用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂，其特征在于，所述用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂为减少mirna的表达水平。
2.如权利要求1所述的用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂，其特征在于，所述用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂包含一段由mir-8545序列的反义互补非编码rna序列。
3.如权利要求2所述的用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂，其特征在于，所述反义互补非编码rna序列的长度为18-24个碱基，优选为20个碱基。
4.如权利要求3所述的用于治理小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性的mirna抑制剂，其特征在于，所述反义互补非编码rna序列的核酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭兆将，朱流红，程周强，董丽娜，郭乐，白杨，张友军，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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