【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于山药病原真菌的田间快速实时可视化检测，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法。
技术介绍
1、山药（ dioscorea opposita），又名薯蓣，隶属于薯蓣科薯蓣属草本植物，其在国内外均有分布。山药具有重要的食用与药用价值，在我国多地均有种植，并有诸多具有地方特色的山药品种。然而山药在种植过程多采用地下茎段、零余子等营养器官进行繁殖，长此以往，其遗传背景多样性降低，易受到病原真菌-链格孢菌（ alternaria alternata）的侵染。在山药中，链格孢菌以侵染山药叶片为主，在叶片中常表现为黑色斑块，造成山药叶片枯死，严重影响叶片的光合作用，如不及时控制链格孢菌的传播，将最终导致山药整体植株的死亡。山药叶片出现黑斑、枯斑可能是由于物理因素或其它生物因素（如昆虫）造成，因而需要加强对链格孢菌的检测，这对于及时有效地开展山药黑斑病的防治工作至关重要。
2、当前，针对植物病原真菌的检测方式已有部分报道，较为常用的有直接观察法、分离培养并联合生物学特征测定法、显微镜观察法以及分子生物学技术（彭丹丹,张源明,舒灿伟,等.植物病原真菌分子检测技术的研究进展[j].基因组学与应用生物学,2017,36(05):2015-2022）。其中，直接观察法是通过观察植物染病后所表现出的症状来推断植物是否符合某一真菌病害的特征来判断。显微镜观察法、分离培养并联合生物学特征测定法主要是通过分离
3、rpa-crispr/cas12a技术在近年来被广泛应用于特定核酸片段的扩增和检测中，其原理为rpa能够在37 ℃下快速扩增出待检测的核酸片段以达到crispr/cas12a的检测最低限度。此时当携带有特异crrna（crispr/rna）的cas12a与病原体核酸片段（经rpa扩增）特异性结合形成crrna-dna-cas12a三元复合物时，cas12a的ruvc酶切位点激活后会发挥其非特异性核酸酶活性（zetsche b, gootenberg js, abudayyeh oo.et al. cpf1 is asingle rna-guided endonuclease of a class 2 crispr-cas system[j]. cell, 2015,163 (3):759-771）（chen j, ma e, lucas b. et al. crispr-cas12a target bindingunleashes indiscriminate single-stranded dnase activity[j]. science, 2018,360(6387)），该状态下的cas12a能够酶切体系中添加的非特异性荧光探针（ssdna reporter）继而释放出荧光信号，该荧光信号既能够及时被qpcr仪捕获，也能够在紫外线/蓝光/可见光下直接用肉眼观察到，可以用来检测特定核酸片段的存在（ding x, yin k, li z. etal. ultrasensitive and visual detection of sars-cov-2 using all-in-one dualcrispr-cas12a assay. nature communication, 2020 (11), 4711）（wang x, zhong m,liu y. et al. rapid and sensitive detection of covid-19 using crispr/cas12a-based detection with naked eye readout, crispr/cas12a-ner[j]. science bulletin, 2020, 65(17)）。
4、当前，rpa-crispr/cas12a检测体系已用于马铃薯y病毒（何雨龙,王佳歌,赵珊珊,等.马铃薯y病毒rpa-crispr/cas12a检测技术体系的建立与应用[j].植物学报, 2022, 57(3): 308-319）、新冠病毒（ding x, yin k, li z. et al. ultrasensitive and visualdetection of sars-cov-2 using all-in-one dual crispr-cas12a assay. nature communication, 2020 (11), 4711）、转基因作物（wang jb, wang y, hu xw. et al. thedevelopment of rpa and crispr-cas12a based immunoassay strip for sensitivedetection of genetically modified crops[j]. food control, 2022）等检测中，但在诊断山药黑斑病病原真菌（链格孢菌）的检测上还未见相关报道。
技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是提供了一种基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于具体过程为：以链格孢菌菌落或疑似感染链格孢菌的山药新鲜叶片为材料进行DNA粗提取制得DNA粗制提取液，再将DNA粗制提取液加入到RPA扩增体系进行扩增反应，扩增反应结束后将RPA扩增产物加入到CRISPR/Cas12a反应体系中进行反应，再将反应体系置于蓝光LED灯下照射进行检测，发出蓝绿光为阳性结果，无发光为阴性结果；
2.根据权利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于具体步骤为：
3. 根据权利要求2所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤S1中真菌分离与纯化的过程为：摘取山药染病叶片样本保持湿润带回实验室，于无菌的超净工作台中，使用体积分数为75%酒精对叶片消毒30 s后置于3vol% NaClO溶液中消毒3 min，消毒结束后，使用无菌蒸馏水冲洗3~5次；在灭菌的培养皿中，使用刀片切取叶片中的患病组织，并将组织叶片接种于PDA培养基中，将其
4. 根据权利要求2所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤S2中真菌DNA提取的过程为：将经液氮速冻的菌丝研磨得到的粉末加入到CTAB提取缓冲液中，该CTAB提取缓冲液的组成为2wt% CTAB、100 mmol·L-1 Tris-HCl、20 mmol·L-1 EDTA、1.4 mol·L-1 NaCl和2vol% β-巯基乙醇，pH 8.0，振荡混匀后，置于65 ℃水浴加热40 min，期间需颠倒混匀，加热混匀后，转速12000 r/min离心10 min，吸取上清于1.5 mL离心管中，再加入等体积的氯仿，颠倒混匀，转速12000 r/min离心10 min，吸取上清，再加入等体积的异丙醇，混匀后于-20 ℃静置20 min，再于室温转速12000 r/min，离心10 min，弃上清，使用体积分数75%乙醇洗涤沉淀2次，最后使用ddH2O溶解沉淀。
5. 根据权利要求2所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤S3中真菌通用ITS区扩增引物以及PCR反应的过程为：真菌通用ITS区扩增引物，ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；PCR反应使用2×Es Taq MasterMix（Cwbio）试剂盒，扩增反应程序为预变性95 ℃ 3 min，循环反应95 ℃30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，终延伸5 min，循环数设定为35。
6.根据权利要求2所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤S4中RPA引物序列的具体制备过程为：
7. 根据权利要求2所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤S5中RPA扩增反应的具体过程为：TwistAmp Basic Kits试剂盒（Twist DX）中Rehydration buffer 29.5 μL，RPA上下游引物各2.4 μL，RPA上下游引物的母液浓度为10 μmoL·L-1，Magnesium Acetate 5 μL，Magnesium Acetate母液浓度280mmol·L-1， A TwistAmp Basic reaction固体粉状试剂1枚，链格孢菌DNA 2 μL，用ddH2O将终体积添加到50 μL，添加完上述组分后，将反应体系振荡混匀，37 ℃孵育5 min，第5 min时，再次振荡混匀反应体系，继续37 ℃孵育至30 min。
8. 根据权利要求2所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤S6中检测的具体过程为：CRISPR/Cas12a反应体系的各组分及配比经过自行优化，具体依照如下条件进行配制，NEBuffer4 2 μL、crRNA 0.025 μmol·L-1、Cas12a重组蛋白0.05 μmol·L-1、RNase inhibitor 10 U和荧光探针4 μmol·L-1，RNasefree ddH2O补至17 μL，将混合组分置于37 ℃加热5 min，促进crRNA与Cas12a形成二元复合物即形成CRISPR/Cas12a反应体系，再将3 μL步骤S5中的RPA扩增反应产物加入到CRISPR/Cas12a反应体系...
【技术特征摘要】
1.基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于具体过程为：以链格孢菌菌落或疑似感染链格孢菌的山药新鲜叶片为材料进行dna粗提取制得dna粗制提取液，再将dna粗制提取液加入到rpa扩增体系进行扩增反应，扩增反应结束后将rpa扩增产物加入到crispr/cas12a反应体系中进行反应，再将反应体系置于蓝光led灯下照射进行检测，发出蓝绿光为阳性结果，无发光为阴性结果；
2.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于具体步骤为：
3. 根据权利要求2所述的基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤s1中真菌分离与纯化的过程为：摘取山药染病叶片样本保持湿润带回实验室，于无菌的超净工作台中，使用体积分数为75%酒精对叶片消毒30 s后置于3vol% naclo溶液中消毒3 min，消毒结束后，使用无菌蒸馏水冲洗3~5次；在灭菌的培养皿中，使用刀片切取叶片中的患病组织，并将组织叶片接种于pda培养基中，将其放置于28 ℃培养箱中培养。
4. 根据权利要求2所述的基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤s2中真菌dna提取的过程为：将经液氮速冻的菌丝研磨得到的粉末加入到ctab提取缓冲液中，该ctab提取缓冲液的组成为2wt% ctab、100 mmol·l-1 tris-hcl、20 mmol·l-1 edta、1.4 mol·l-1 nacl和2vol% β-巯基乙醇，ph 8.0，振荡混匀后，置于65 ℃水浴加热40 min，期间需颠倒混匀，加热混匀后，转速12000 r/min离心10 min，吸取上清于1.5 ml离心管中，再加入等体积的氯仿，颠倒混匀，转速12000 r/min离心10 min，吸取上清，再加入等体积的异丙醇，混匀后于-20 ℃静置20 min，再于室温转速12000 r/min，离心10 min，弃上清，使用体积分数75%乙醇洗涤沉淀2次，最后使用ddh2o溶解沉淀。
5. 根据权利要求2所述的基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于步骤s3中真菌通用its区扩增引物以及pcr反应的过程为：真菌通用its区扩增引物，its1：tccgtaggtgaacctgcgg，its4：tcctccgcttattgatatgc；pcr反应使用2×es taq mastermix（cwbio）试剂盒，扩增反应程序为预变性95 ℃ 3 min，循环反应95 ℃30 s...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨清香，何雨龙，王瑞飞，李明军，张江利，张昊，赵伟超，仝辰炜，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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