【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体地，涉及一种合成白桦脂酸的基因组合、重组质粒组合、菌株和异源生物合成白桦脂酸的方法。具体地，涉及莲藕中白桦脂酸合成相关p450细胞色素氧化酶基因(lrcyp)、莲藕中白桦脂酸合成相关p450s细胞色素还原酶基因(lrcpr)和莲藕中白桦脂酸合成相关羽扇豆醇合酶基因(lrlups)、含有所述基因片段的重组表达载体、一种基因工程化的酿酒酵母，以及一种异源生物合成白桦脂酸的方法。
技术介绍
1、白桦脂酸(c30h48o3，betulinic acid)，又称为桦木酸，是一种羽扇豆烷型五环三萜类化合物，最早从白桦树树皮中提取获得。白桦脂酸具有多种药理活性，现代药理研究表明，白桦脂酸及其衍生物具有如抗炎、抗肿瘤、抗hiv等多种药理活性，具有较好的成药前景。白桦脂酸的来源主要有两条途径，一是植物中提取，二是化学半合成方法，以白桦脂醇为底物来制备白桦脂酸。前者产量低、浪费自然资源、生产成本高。后者需从植物中提取白桦脂醇作为反应底物，原料耗费多、合成过程复杂、产物纯化困难、环境污染严重，不符合环境友好的原则。相比之下，采用微生物发酵法合成白桦脂酸具有更加绿色环保的优势。
2、莲藕(nelumbo nucifera gaertn)是植物莲的肥大根茎，属睡莲科莲属，其作为药用植物在中国已有上千年的历史，《本草纲目》记载“藕可交心肾，厚肠胃，强筋骨，固精气，补虚损”。莲藕富含多种活性成分，包括黄酮、生物碱、萜类、多糖等，具有抗氧化、预防酒精性肝病、增强免疫力、抗炎、抗肿瘤等作用。从莲藕中发现的三萜类物质就包
3、莲藕中活性成分的研究大多集中在研究相关鉴定方法，对于该物质在莲藕中是如何合成，合成涉及到的基因等没有相关报道。白桦脂酸合成关键酶基因包括p450细胞色素氧化酶基因(cyp)、p450细胞色素还原酶基因(cpr)和羽扇豆醇合酶基因(lups)。已报道合成白桦脂酸的酶基因大多来源于模式物种，如长春花、拟南芥等，来源其他物种的酶基因报道较少，且相关功能的酶基因非合成白桦脂酸最适基因，利用这些酶基因发酵得到的生成量不足以用于生产。莲藕中具有多种白桦脂酸合成关键酶基因，可以扩大其合成酶基因的数量与种类，为后期大规模生产白桦脂酸奠定基础。
4、综上所述，当前亟需挖掘不同物种的p450s，增加具有合成白桦脂酸功能的酶基因，以构建合成白桦脂酸的重组菌株，为实现通过微生物发酵工程生产白桦脂酸奠定基础。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种合成白桦脂酸的基因组合、重组质粒组合、菌株和异源生物合成白桦脂酸的方法。
2、本专利技术的第一方面提供一种合成白桦脂酸的基因组合，包括以下基因片段：
3、羽扇豆醇合酶基因lrlupf，其核苷酸序列如seq id no：1所示，氨基酸序列如seqid no：2所示；
4、p450细胞色素氧化酶基因lrcypa或lrcypb，lrcypa的核苷酸序列如seq id no：3所示，氨基酸序列如seq id no：4所示，lrcypb的核苷酸序列如seq id no：5所示，氨基酸序列如seq id no：5所示；
5、p450细胞色素还原酶基因lrcprh或ljcpr，lrcprh的核苷酸序列如seq id no：7所示，氨基酸序列如seq id no：8所示，ljcpr的核苷酸序列如seq id no：9所示，氨基酸序列如seq id no：10所示。
6、本专利技术中，所述羽扇豆醇合酶基因lrlupf、p450细胞色素氧化酶基因lrcypa、p450细胞色素氧化酶基因lrcypb、p450细胞色素还原酶基因lrcprh来源于莲藕相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得；p450细胞色素还原酶基因ljcpr来源于百脉根相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得。
7、本专利技术的第二方面提供一种合成白桦脂酸的重组质粒组合，含有所述的基因组合中的基因片段；所述重组质粒为大肠杆菌表达载体和/或酿酒酵母表达载体；优选地，所述大肠杆菌表达载体以pet-28a为原始载体，所述酿酒酵母表达载体以pesc-ura和pesc-leu为原始载体。
8、根据本专利技术一种优选实施方式，所述重组质粒组合选自以下组合中的至少一种：
9、(i)酵母重组质粒pesc-ura-lrcypa-lrcprh与酵母重组质粒pesc-leu-lrlupf的组合；
10、(ii)酵母重组质粒pesc-ura-lrcypa-ljcpr与酵母重组质粒pesc-leu-lrlupf的组合；
11、(iii)酵母重组质粒pesc-ura-lrcypb-lrcprh与酵母重组质粒pesc-leu-lrlupf的组合；
12、(iv)酵母重组质粒pesc-ura-lrcypb-ljcpr与酵母重组质粒pesc-leu-lrlupf的组合。
13、本专利技术的第三方面提供一种合成白桦脂酸的菌株，其中含有上述的重组质粒组合。所述菌株可以为大肠杆菌或酿酒酵母，所述大肠杆菌优选为bl21(de3)，所述酿酒酵母菌株优选为by4741、mva代谢途径改造的by4741或by4742。所述mva代谢途径改造的by4741的基因组ho位点中整合有酿酒酵母自身mva途径限速酶基因hmg1和erg20。构建所述mva代谢途径改造的by4741的方法包括：过表达酿酒酵母自身mva途径限速酶基因hmg1和erg20，将其整合至by4741基因组ho位点，以提高白桦脂酸合成前体供应。
14、本专利技术的第四方面提供一种异源生物合成白桦脂酸的方法，包括：将上述的菌株进行发酵培养，合成得到白桦脂酸。优选地，所述发酵培养的条件包括：培养基初始ph为5.8-6.2，初始od600值为0.8-1.2，发酵半乳糖浓度为5.5-6.5％，扩大发酵培养基体积为150-500ml，发酵时间为55-65h。
15、本专利技术的技术路线如图1所示：采用高通量测序平台(dnbseq)对“鄂莲五号”品种莲藕的六个不同生长时期进行转录组学分析，筛选可能参与白桦脂酸合成的p450细胞色素氧化酶基因(cyp)、p450细胞色素还原酶基因(cpr)和羽扇豆醇合酶基因(lup)。从莲藕中克隆得到羽扇豆醇合酶基因lrlup、p450细胞色素氧化酶基因lrcyp、p450细胞色素还原酶基因lrcpr，分别构建重组表达质粒。将酵母质粒转化入酿酒酵母中，构建重组酿酒酵母，进行异源表达。通过对转化后的菌株进行发酵筛选，筛选得到合成白桦脂酸的lrlup-f、lrcyp-a、lrcyp-b、lrcpr-h。最后，通过特定基因优化、底盘菌株改造和发酵条件优化等方法，优化重组酿酒酵母，提升其白桦脂酸产量。
16、本专利技术所述的异源表达具体是指：以莲藕总rna反转录后的cdna为模板，通过pcr扩增候选的各个lrlup、lrcyp、lrcpr表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成白桦脂酸的基因组合，包括以下基因片段：
2.根据权利要求1所述的合成白桦脂酸的基因组合，其中，所述羽扇豆醇合酶基因LrLUPF、P450细胞色素氧化酶基因LrCYPA、P450细胞色素氧化酶基因LrCYPB、P450细胞色素还原酶基因LrCPRH来源于莲藕相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得；P450细胞色素还原酶基因LjCPR来源于百脉根相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得。
3.一种合成白桦脂酸的重组质粒组合，含有权利要求1或2所述的基因组合中的基因片段；所述重组质粒为大肠杆菌表达载体和/或酿酒酵母表达载体；优选地，所述大肠杆菌表达载体以pET-28a为原始载体，所述酿酒酵母表达载体以pESC-URA和pESC-LEU为原始载体。
4.根据权利要求3所述的合成白桦脂酸的重组质粒组合，其中，所述重组质粒组合选自以下组合中的至少一种：
5.一种合成白桦脂酸的菌株，其中含有权利要求3或4所述的重组质粒组合。
6.根据权利要求5所述的菌株，其中，所述菌株为大肠杆菌或酿酒酵母，所述大
7.根据权利要求6所述的菌株，其中，所述MVA代谢途径改造的BY4741的基因组HO位点中整合有酿酒酵母自身MVA途径限速酶基因HMG1和ERG20。
8.根据权利要求7所述的菌株，其中，构建所述MVA代谢途径改造的BY4741的方法包括：过表达酿酒酵母自身MVA途径限速酶基因HMG1和ERG20，将其整合至BY4741基因组HO位点，以提高白桦脂酸合成前体供应。
9.一种异源生物合成白桦脂酸的方法，包括：将权利要求5-8中任意一项所述的菌株进行发酵培养，合成得到白桦脂酸。
10.根据权利要求9所述的异源生物合成白桦脂酸的方法，其中，所述发酵培养的条件包括：培养基初始pH为5.8-6.2，初始OD600值为0.8-1.2，发酵半乳糖浓度为5.5-6.5％，扩大发酵培养基体积为150-500mL，发酵时间为55-65h。
...【技术特征摘要】
1.一种合成白桦脂酸的基因组合，包括以下基因片段：
2.根据权利要求1所述的合成白桦脂酸的基因组合，其中，所述羽扇豆醇合酶基因lrlupf、p450细胞色素氧化酶基因lrcypa、p450细胞色素氧化酶基因lrcypb、p450细胞色素还原酶基因lrcprh来源于莲藕相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得；p450细胞色素还原酶基因ljcpr来源于百脉根相关基因并依据酿酒酵母密码子偏好进行基因碱基优化而得。
3.一种合成白桦脂酸的重组质粒组合，含有权利要求1或2所述的基因组合中的基因片段；所述重组质粒为大肠杆菌表达载体和/或酿酒酵母表达载体；优选地，所述大肠杆菌表达载体以pet-28a为原始载体，所述酿酒酵母表达载体以pesc-ura和pesc-leu为原始载体。
4.根据权利要求3所述的合成白桦脂酸的重组质粒组合，其中，所述重组质粒组合选自以下组合中的至少一种：
5.一种合成白桦脂酸的菌株，其中含有权利要求3或4所述的重组质粒组合。
6.根据权利要求5...
【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，宋丹丹，叶诗洁，王宏勋，易阳，李龙杰，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：
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