【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质工程和酶催化领域，具体涉及通过对多酶共催化合成癸二酸体系中的仲醇脱氢酶进行定向进化，将其辅因子偏好性由nad+转变为nadp+，使其与下一级反应的单加氧酶(bvmo)的辅因子相匹配，实现体系内单辅因子催化及辅因子nadp+/nadph再生自循环。
技术介绍
0、技术背景
1、长链α,ω-二元羧酸(α,ω-dca)被频繁和广泛地用于生产各种化学品和中间体，在医药、香料，尤其是高分子领域具有广泛应用。传统工业生产中，α,ω-dca由石化原料或特殊脂肪酸(蓖麻酸)经氧化裂解制得，反应条件苛刻，涉及高温、高压、强酸催化剂(如h2so4、hno3)和有毒氧化剂(如臭氧、过氧化氢)。该工艺始终存在着低产率、高能耗、副产物不可控等问题，对环境危害严重，不符合现代的“绿色和可持续发展”理念。生物合成具有条件温和、对环境友好、区域立体选择性和对映体选择性高的优点，有望替代化学合成成为工业生产二元羧酸的新工艺。
2、2013年song报道了以油酸为原料的酶法级联工艺来生产癸二酸(附图2)，具体过程是：(1)油酸的不饱和碳-碳双键被水合酶羟基化；(2)nad+依赖的仲醇脱氢酶(adh)催化羟基脱氢还原为羰基；(3)nadph依赖的单加氧酶(bvmo)经过baeyer-villiger氧化反应生成“正常”构型酯(1-壬酸-9-羟基壬酯)和“异常”构型酯(1,10-癸二酸-1-辛酯)；(4)1,10-癸二酸-1-辛酯水解得到癸二酸。(song,j.w.；jeon,e.y.；song,d.h.；jang,h.y.
3、该多酶级联催化合成癸二酸体系中，两种氧化还原酶的辅因子特异性不同，adh需要nad+并将其转化为nadh，而bvmo需要nadph并将其转化为nadp+，nadph与酶促过程中的电子传递和氧气激活有关，bvmo的氧化速率受到nadph的限制。因此，实现nadph再生能大大提高bvmo的催化效率，同时降低体外级联反应的成本。
4、过量添加辅因子会使生产成本大幅增加。目前常用的方法是额外添加辅因子再生系统。例如，对于adh催化过程的nad+再生，通常添加nadh氧化酶(nox)，利用氧气将nadh重新氧化为nad+；对于bvmo催化过程的nadph再生，通常添加6-葡萄糖脱氢酶(gdh)催化葡萄糖生成葡萄糖酸的同时将nadp+还原为nadph。然而，在统一的反应条件下对于其中一个酶可能不是最优的，需要对多个酶的速率进行匹配优化以实现级联反应的最大催化效率，若不断增加酶数量和底物，会增加多酶匹配的复杂性，同时产生的副产物增加了癸二酸的提纯难度。因此构建基于级联反应的辅因子原位循环再生系统具有重要意义。
5、该癸二酸合成体系中基于级联反应的nadp+/nadph原位循环再生系统，即adh酶促反应和bvmo酶促反应相耦合，在体外加入少量的nadp+，adh突变体在催化底物的同时将nadp+转化成bvmo所需的nadph，bvmo能够利用adh的催化产物并将nadph氧化为nadp+，从而形成辅因子再生的闭合循环。
6、通过蛋白质工程改变辅因子特异性为辅因子循环原位再生体系的构建提供了一种新思路。例如，seo等人通过仲醇脱氢酶(micrococcus luteus)的辅因子特异性转换，成功将工程酶(adh_d37s/a38r/v39s/t15i)偶联到nadph依赖型bvmo上(pseudomonas putidakt2440)，实现从蓖麻油酸到羟基壬酸体系中辅因子再生。(seo,e.j.；kim,h.j.；kim,m.j.；kim,j.s.；park j.b.cofactor specificity engineering of a long-chain secondaryalcohol de-hydrogenase from micrococcus luteus for redox-neutralbiotransformation of fatty acids.chemical communications,2019,55(96),14462-14465.)tishkov等人通过理性设计由天然nad+依赖的甲醇脱氢酶(pseudomonas sp.101，fdh)筛选得到了nadp+特异性甲醇脱氢酶，并与醇脱氢酶和单加氧酶结合，分别合成r-醇和手性内酯。(tishkov,v.i.；galkin,a.g.；fedorchuk,v.v.pilot scale production andisolation of recombinant nad+-and nadp+-specific formatedehydrogenases.biotechnology and bioengineering,1999,64(2):187-193.)bommareddy等人成功将来自谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的辅因子特异性从nad+改变为nadp+，提高了糖酵解途径中赖氨酸的产量。(bommareddy,r.r.；chen,z.；rappert,s.；zeng,a.p.a de novo nadph generationpathway for improving lysine production of corynebacterium glutamicum byrational design of the coenzyme specificity of glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase.metabolic engineering,2014,25,30-37.)beier等人通过计算设计将不动杆菌(acinetobactersp.ncimb 9871)中环己酮单加氧酶的辅因子偏好性从nadph切换到nadh。(beier,a.；bordewick,s.；genz,m.；schmidt,s.；van den bergh,t.；peters,c.；joosten,h.j.；bornscheuer,u.t.switch in co-factor specificity of a 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于仲醇脱氢酶定向进化的癸二酸合成体系中NADPH原位再生系统的构建方法，其特征在于，包括步骤如下：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，对源自黄色微球菌(Micrococcus luteusWIUJH20，NCBI参考序列：ADD83022.1)的仲醇脱氢酶定点改造。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，仲醇脱氢酶突变体ADH_D37G将序列表中如SEQ ID NO:1所示的仲醇脱氢酶的第37位天冬氨酸替换为甘氨酸，其核苷酸序列对应于序列表中SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，仲醇脱氢酶突变体ADH_D37G/A38T/V39K将序列表中如SEQ ID NO:1所示的仲醇脱氢酶的第37位天冬氨酸替换为甘氨酸，第38位丙氨酸替换为苏氨酸，第39位缬氨酸替换为赖氨酸，其核苷酸序列对应于序列表中SEQ ID NO:3。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将前述得到的仲醇脱氢酶突变体(ADH_D37G或ADH_D37G/A38T/V39K)应用于现有的多酶催化合成癸二酸体系，具体过程包括
...【技术特征摘要】
1.一种基于仲醇脱氢酶定向进化的癸二酸合成体系中nadph原位再生系统的构建方法，其特征在于，包括步骤如下：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，对源自黄色微球菌(micrococcus luteuswiujh20，ncbi参考序列：add83022.1)的仲醇脱氢酶定点改造。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，仲醇脱氢酶突变体adh_d37g将序列表中如seq id no:1所示的仲醇脱氢酶的第37位天冬氨酸替换为甘氨酸，其核苷酸序列对应于序列表中seq id no:2。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，仲醇脱氢酶突变体adh_d37g/a38t/v39k将序列表中如seq id no:1所示的仲醇脱氢酶的第37位天冬氨酸替换为甘氨酸，第38位丙氨酸替换为苏氨酸，第39位缬氨酸替换为赖氨酸，其核...
【专利技术属性】
技术研发人员：聂开立，陆洁，芦东，武秋阳，金淑铭，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
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