一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺制造技术

技术编号：40840177 阅读：2 留言：0更新日期：2024-04-01 15:06

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，涉及一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，所述工艺使用优化的表达载体、表达宿主及培养基的优化组合，采用大肠杆菌蛋白表达感受态细胞Rosetta(DE3)作为宿主、pET21a作为表达载体，选用TB培养基并采用优化的培养条件进行培养，无需采用融合蛋白标签，表达的MRI的产量可达到8.93mg/L，目标蛋白活力均值可达714538U/L，其效果比现有技术采用了可溶性标签的产量和比活更高，产量提升了4‑8倍，同时避免了加减标签和包涵体复性的繁复操作和其中产生的活性丧失，缩短生产周期，节约生产成本。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，具体涉及一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺。

技术介绍

1、核糖核酸酶抑制剂(rnase inhibitor，ri)是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性胞浆蛋白，它与核糖核酸酶(rnase)以1：1的比例结合，从而抑制rnase活性。它是一个防止潜在rnase污染的十分有效的试剂。其分子量约为50kda，等电点为4.7左右。与人源rnaseinhibitor.相比，小鼠rnase inhibitor不含人源蛋白中的两个对氧化非常敏感的半胱氨酸，因而具有更高的抗氧化活性。

2、目前，商品的rnase inhibitor以鼠源、猪源、人源的rnase inhibitor较为常见，但因鼠源ri抗氧化活性高，同时适合于对高dtt敏感性实验，因此在市场中较为常见。ri的获得大多采用基因重组方式在原核表达系统(如大肠杆菌)与真核表达系统(如酵母和细胞)表达两种形式，其中真核表达系统表达周期太长且成本太高，因此以大肠杆菌为宿主的重组蛋白原核表达方法更为常用。尽管原核表达的方法比真核表达节约了成本，但原核表达极易产生包涵体，ri基因在大肠杆菌中的表达产物，多数以无活性的包涵体形式存在，产生无活性蛋白产物，需要额外进行体外复性方可得到有活性的ri，而变复性工艺使用高浓度变性剂如盐酸胍、尿素等对包涵体进行溶解变性，进而进行复性，工艺复杂且进行体外折叠后复性率低。例如中国专利公开了一种rnasin的制备方法，其采用原核表达系统表达rnasin，为了提高得率在纯化过程中使用变复性工艺来增加可溶性rnasin的量。</p>

3、为提升可溶表达量，研究人员开发了添加融合标签、改造工程菌等工艺方法提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达，减少包涵体的产生，避免了复性的繁琐工艺。例如，中国专利号cn102234649a公开了一种活性重组核糖核酸酶抑制剂的高效可溶性表达方法，公开了采用原核表达系统bl27工程菌表达小鼠核糖核酸酶抑制剂(mri)，其在ri序列5’-端加入了trxa硫氧还蛋白融合标签，制备后纯化得到的mri的收取量约为1～2mg/l，比活性约为39kunits/mg。但基于融合标签可溶表达的活性蛋白后续还需要利用tev蛋白酶处理去除trxa标签，不仅增加了繁琐的去标签步骤，并且去除标签步骤会影响目标蛋白的活性，由此造成已表达的蛋白的活性损失。

4、鉴于此，开发出一种高效、可溶性表达且产量高、活性高、成本低的mri制备工艺是是十分有必要的。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于：针对目前原核系统表达ri操作繁琐、产量和活性低的我问题，提供了一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺，无需借助可溶标签，亦可大幅提升ri的可溶表达量，进而能够采用简单而低成本的方式提高ri的产量，并且制备出的ri不会再产生活性损失。

2、本专利技术的技术方案如下：

3、一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂工艺，包括以下步骤：

4、步骤s1：构建重组表达载体，所述表达载体为利用大肠杆菌质粒在ndei和ecori酶切位点插入序列如seq id no.1所示的mri基因得到重组的大肠杆菌表达质粒；

5、步骤s2：培养表达，将所述大肠杆菌质粒转化至大肠杆菌蛋白表达感受态细胞中获得阳性克隆，再将所述阳性克隆于生长培养基中，37℃，180-220r/min培养12-16h，再接种至诱导培养基中，16-37℃，180-220r/min培养，培养时间为4-24h；

6、步骤s3：分离并纯化，将所述培养菌体依次经过破菌、层析步骤获得目的蛋白。

7、根据一种优选的实施方式，所述大肠杆菌质粒为pet21a，所述大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自bl21(de3)、bl21(de3)-pg-tf2、rosetta(de3)中的任一种。

8、根据一种优选的实施方式，所述mri基因的n端或c端引入his标签。

9、进一步的，大肠杆菌质粒为pet21a，大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自bl21(de3)、bl21(de3)-pg-tf2、rosetta(de3)中的任一一种

10、进一步的，生长培养基选自lb、tb培养基，诱导培养基选自lb、tb、zyp培养基中任一一种。

11、进一步的，生长培养基的培养条件为37℃摇床培养12-16h。

12、进一步的，诱导培养基的培养条件还包括待od为0.6-0.8时，加入诱导剂开始诱导。

13、进一步的，诱导剂为异丙基硫代半乳糖，其浓度范围为0.1mm/l～1.5mm/l。

14、进一步的，诱导温度为20℃～37℃，诱导时长为16-24h。

15、进一步的，接种于生长培养基的菌落为单菌落；诱导培养基上的接种量为l‰。

16、进一步的，层析步骤依次包括亲和层析、离子交换层析和疏水层析。

17、与现有的技术相比本专利技术的有益效果是：

18、1、一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺，与现有增加融合标签使得目标蛋白可溶性表达的制备工艺相比，本申请的制备方法通过对表达载体、表达宿主及培养基的优化组合，使得ri大量可溶表达，制备出的产量高、活性好的ri，采用本申请的制备工艺制备出的目标蛋白活力均值可达714538u/l，即最终可以获得8.93mg/l的活性ri；其产量较现有采用了可溶标签的产量更高，且避免了繁琐的加标签和去标签步骤和活性损失，亦无需包涵体复性工艺，工艺简单，缩短了生产周期，节约生产成本，经济性好，产量高；

19、2、一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺，本申请的制备工艺采用的培养基更适合高密度的发酵技术，纯化工艺简单，利于mri规模化生产，极大程度上满足不断增长的研究及广泛的应用需求。

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【技术保护点】

1.一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，步骤S1中所述大肠杆菌质粒为pET21a，步骤S2中所述大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自BL21、BL21-pG-Tf2或Rosetta的任一种。

3.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长培养基选自LB、TB培养基中的任一一种，所述诱导培养基选自LB、TB、ZYP培养基中任一一种。

4.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长培养基的培养条件为37℃摇床培养12-16h。

5.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述诱导培养基的培养条件还包括：待OD为0.6-0.8时，加入诱导剂开始诱导。

6.根据权利要求5所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖，其浓度范围为0.1mM/L～1.5mM/L。

7.根据权利要求6所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述诱导温度为20℃～37℃，所述诱导时长为16-24h。

8.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述接种于所述生长培养基的菌落为单菌落；所述诱导培养基上的接种量为l‰。

9.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述MRI基因的N端或C端引入His标签。

10.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述分离纯化步骤包括层析，所述层析依次包括亲和层析、离子交换层析和疏水层析。

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【技术特征摘要】

1.一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，步骤s1中所述大肠杆菌质粒为pet21a，步骤s2中所述大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自bl21、bl21-pg-tf2或rosetta的任一种。

3.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长培养基选自lb、tb培养基中的任一一种，所述诱导培养基选自lb、tb、zyp培养基中任一一种。

4.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长培养基的培养条件为37℃摇床培养12-16h。

5.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述诱导培养基的培养条件还包括：待od为0.6-0.8时，加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文，孟绪斌，张春晨，李红东，李明，
申请(专利权)人：西安天隆科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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