【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体涉及一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺。
技术介绍
1、本节中的陈述仅提供与本申请公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。
2、核糖核酸酶抑制剂(rnase inhibitor，ri)是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性胞浆蛋白，广泛存在于哺乳动物组织中，其分子量约为50kda，等电点为4.7左右，它与核糖核酸酶(rnase)以1：1的比例结合能够抑制rnase活性，从而用于防止核糖核酸酶污染可能引起的问题如mrna反转录实验，无细胞的体外蛋白翻译实验，和其他涉及rna研究的工作中。
3、目前，商品化的ri以鼠源、猪源、人源的较为常见，但因鼠源ri抗氧化活性高，同时适合于对高dtt敏感性实验，市场较为普遍。ri的获得大多采用基因重组方式在原核表达系统(如大肠杆菌)与真核表达系统(如酵母和细胞)表达，但是真核表达系统表达周期太长且成本太高，所以以大肠杆菌为宿主的重组蛋白原核表达方法更为广泛。由于宿主的折叠机制无法应对快速积累的目标蛋白折叠和/或促进-sh基团的有效稳定，ri在大肠杆菌中的聚集是一种常见的现象，到目前为止，在酿酒酵母(vicentini,anna m.,et al."proteinchemical and kinetic characterization of recombinant porcine ribonucleaseinhibitor expressed in saccharomyces cerevisiae."biochemistry 29.37(1
4、鉴于此，开发出一种产量高、活性高、成本低的高效制备可溶性mri的工艺是十分有必要的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于：针对目前原核系统生产ri工艺繁琐，且收取量仍然较低的问题，提供了一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，经分离纯化后获得了49.55mg/l的可溶性表达产物ri，产量高达现有技术的6-10倍，且无需繁琐的操作步骤。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，包括以下步骤：
4、(1)构建重组表达载体：构建重组表达载体，表达载体为利用大肠杆菌质粒在ncoi和ecor i酶切位点插入ri基因得到重组的大肠杆菌表达质粒；
5、(2)培养表达，将重组后的大肠杆菌表达质粒转化至大肠杆菌蛋白表达感受态细胞中获得阳性克隆，再将阳性克隆于生长诱导培养基上进行诱导表达，待od值为2.0～2.5时进行诱导；
6、(3)收集并纯化获得目的蛋白。
7、菌体培养过程中，在一定容量的培养基中，一般而言，od0.6-0.8时，菌体活力较好，是最佳诱导od，诱导后，它们一边菌体增殖，一边表达蛋白；一般蛋白在od为2.0以后，菌落衰退，菌体活力不好，诱导后，表达量很少，或者停止生长。本专利技术的申请人意外发现rna酶抑制剂在诱导表达过程中用了高od诱导，表达量没降，反而较常规的诱导od有相当大的提升，产生了意想不到的技术效果。
8、根据一种优选的实施方式，所述大肠杆菌表达质粒为pet21a，大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自bl21(de3)、bl21(de3)-pg-tf2、rosetta(de3)中的任一种。
9、根据一种优选的实施方式，ri基因的n端或c端引入his标签。
10、根据一种优选的实施方式，所述生长诱导培养基包含lb和tb培养基，
11、根据一种优选的实施方式，tb培养基包含1.0～1.4％胰蛋白胨、2.0～2.4％酵母提取物、0.65-0.75m/l磷酸氢二钾、0.15-0.25m/l磷酸二氢钾、0.4～0.6％甘油。
12、根据一种优选的实施方式，所述lb培养基的培养条件包括37℃摇床培养12～16h；
13、tb培养基的培养条件包括诱导温度范围为16～37℃，诱导剂浓度为0.1～1.5mm/l，诱导时长范围为4～24h。
14、根据一种优选的实施方式，tb培养基的培养条件包括诱导温度16～20℃，诱导剂浓度0.25～1.0mm/l，诱导时间16～24h。
15、根据一种优选的实施方式，步骤(2)中生长诱导培养基诱导表达条件还包括在进行诱导之前向生长诱导培养基中加入添加量范围为2～8mm的tcep。
16、根据一种优选的实施方式，在进行诱导之前向生长诱导培养基中加入添加量范围为2～6mm的tcep。
17、根据一种优选的实施方式，步骤(3)中，所述纯化包括收集诱导培养液，依次经过分离、亲和层析和离子层析。
18、根据一种优选的实施方式，所述亲和层析步骤中采用的介质为45～165μm的ni-ted琼脂糖凝胶。
19、进一步的，诱导剂为异丙基硫代半乳糖(iptg)。
20、进一步的，离子层析步骤中采用的介质为50μm的强阴离子交换层析填料。
21、进一步的，本申请的工艺还包括向获得的目的蛋白中添加5mm的tcep。
22、与现有技术相比，本专利技术提供的一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺的有益效果是：
23、1.一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，与增加融合标签使目标基因可溶性表达相比，本专利技术采用原核表达系统，通过对表达宿主、培养基、诱导条件的优化组合，经分离纯化后获得了49.55mg/l高产量的可溶性表达产物ri，不仅避免了增加可溶标签繁琐的制备步骤和去除可溶标签影响目标蛋白活性的问题，而且免除了包涵体复杂变复性工艺，缩短了生产周期，节约了生产成本，经济性好，产量高。
24、2.一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，本专利技术的制备工艺采用的培养基更适合高密度的发酵技术，纯化工艺仅需要亲和层析和离子层析两步层析本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述大肠杆菌表达质粒为pET21a，大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自BL21、BL21-pG-Tf2、Rosetta中的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长诱导培养基包含LB培养基和TB培养基。
4.根据权利要求3所述的一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述LB培养基的培养条件包括37℃摇床培养12～16h；
5.根据权利要求4所述的一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，TB培养基的培养条件包括诱导温度16～20℃，诱导剂浓度0.25～1.0mM/L，诱导时间16～24h。
6.根据权利要求1所述的一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长诱导培养基的诱导表达条件还包括在进行诱导之前向生长诱导培养基中加入添加量范围为2～8mM的TCEP。
7.根据权利要求6所
8.根据权利要求1所述的一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，步骤(3)中，所述纯化包括收集诱导培养液，依次经过分离、亲和层析和离子层析。
9.根据权利要求8所述的一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述亲和层析步骤中采用的介质为45～165μm的Ni-TED琼脂糖凝胶。
10.根据权利要求1所述的一种高效制备可溶性RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，还包括向获得的目的蛋白中添加5mM的TCEP。
...【技术特征摘要】
1.一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述大肠杆菌表达质粒为pet21a，大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自bl21、bl21-pg-tf2、rosetta中的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长诱导培养基包含lb培养基和tb培养基。
4.根据权利要求3所述的一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述lb培养基的培养条件包括37℃摇床培养12～16h；
5.根据权利要求4所述的一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺，其特征在于，tb培养基的培养条件包括诱导温度16～20℃，诱导剂浓度0.25～1.0mm/l，诱导时间16～24h。
6.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟绪斌，韩文，张春晨，孙青，李红东，李明，
申请(专利权)人：西安天隆科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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