【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体为一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法及其应用。
技术介绍
1、致癌性评价是新药研发中非临床安全性评价的重要组成部分，可以识别药物潜在的致癌作用，选择合适的动物模型可以有效暴露药物潜在的致癌性，极大程度影响药物致癌性评价的数据和结果。
2、为了满足药物致癌性评价的动物模型需求，市面上已有转基因动物模型(p53+/-缺失模型、tgac模型、tghras2模型、xpa缺失模型等)，通过转入原癌基因、敲除抑癌基因等方法使转基因动物对致癌性因素更加敏感，从而弥补使用大鼠开展致癌性评价试验的缺陷。
3、由日本ciea研发的rash2转基因小鼠转入了经过修饰的原癌基因hras，增加了转基因小鼠对外界刺激因素的敏感性，使其更容易产生自发恶性癌症。文献报导rash2小鼠在阳性致癌物甲基亚硝基脲mnu的刺激下，出现了自发原位的恶性淋巴瘤、胃癌、皮肤癌，上述癌种的发生率在30％-50％之间，同时还伴随有自发肺癌、卵巢癌等表型，证实了rash2小鼠应用于致癌性评价试验的可行性。与大鼠相比，使用rash2小鼠开展致癌性评价试验具有缩短试验周期(半年)、减少50％的动物使用数量、减少试验成本费用、增加自发癌症概率等优势，因而在药物致癌性评价中具有重要的应用价值。
4、rash2转基因小鼠采用的hras基因中含有源自恶性黑色素瘤病人hras基因的启动子区域和膀胱腺癌hras原癌基因中的内含子突变位点，通过随机转基因的方式以三拷贝串联序列插入在小鼠染色体15e3区域。rash2转基因小鼠
5、但是传统的致癌性评价试验多使用大鼠开展，由于诱导癌症发生的因素复杂且概率偏低，使用大鼠开展致癌性评价具有评价周期长(2年)、试验费用高昂、每组动物数量多、自发肿瘤概率偏低等缺点。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法及其应用，采用构建hras人源化小鼠进行致癌验证更为高效，且通过的发生率高，在验证过程中可以快速发现，达到减小验证周期的目的，减小了试验费用，自发肿瘤概率高等优点，解决了
技术介绍
提出的问题。
3、(二)技术方案
4、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法，包括以下步骤：
5、tg-hras小鼠构建：通过原核注射的方式将构建的载体注射到小鼠受精卵中，在小鼠的基因组中随机插入人的hras基因片段，包含hras基因调控序列以及表达序列，所述人的hras基因序列片段如seq id no.1所示；
6、pmd18-t骨架载体构建：以pmd18-t载体为模板，高保真pcr扩增获得2.7kb的线性化pmd18-t载体，胶回收作为slic反应的骨架；
7、hras片段准备：人源hras分为3段准备，以bac为模板制备片段，高保真酶pcr扩增获得相应片段，胶回收作为slic反应的片段；
8、slic连接：将pmd18-t载体、hras-h1、hras-h2与hras-h3序列进行slic连接，通过pcr鉴定、酶切及测序鉴定方法进行鉴定；
9、移植产物准备：用ecorv酶切，得到6488+2698bp条带，回收6488bp产物，用于移植；
10、移植注射获得阳性鼠：将移植产物注射到受精卵，移植至假孕小鼠，获得阳性f0，对假孕生的仔鼠进行基因型鉴定并测序，筛选成功插入正确人源片段的阳性鼠f0小鼠；
11、founder鼠建系：将获得的f0配繁背景鼠获得f1，f1再与背景鼠配繁获得f2，每代均与背景鼠配繁获得阳性后代，并用qpcr监测拷贝数，持续检测至n5代，小鼠拷贝数维持在4，建系成功。
12、优选的，所述slic连接中鉴定成功的载体命名为tg-hras-donor。
13、如上述的一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法的应用，包括人源hras mrna表达验证：
14、取阳性小鼠以及背景鼠的不同组织，使用trizol法提取rna，采用逆转录方法获得样本，进行qrt-pcr鉴定。
15、如上述的一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法的应用，包括人源hras蛋白表达验证：
16、将balb/c雌鼠与b6-hhras雄鼠配繁获得balb/c；b6及balb/c；b6-tg取阳性小鼠以及背景鼠的肺、肝、皮肤、脾、前胃、胸腺组织，使用western blot技术检测hras蛋白。
17、如上述的一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法的应用，包括小鼠自发成瘤验证。
18、如上述的一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法的应用，包括致癌物mnu诱发小鼠致癌验证。
19、(三)有益效果
20、与现有技术对比，本专利技术具备以下有益效果：
21、通过构建hras人源化小鼠，采用该小鼠进行致癌验证通过验证实验数据可知，该验证结果更为高效，且通过的发生率高，在验证过程中可以快速发现，达到减小验证周期的目的，减小了试验费用，自发肿瘤概率高。
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1.一种用于致癌性评价的HRAS人源化小鼠的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于致癌性评价的HRAS人源化小鼠的构建方法，其特征在于：所述SLIC连接中鉴定成功的载体命名为Tg-HRAS-donor。
3.如权利要求1-2中任一项所述的一种用于致癌性评价的HRAS人源化小鼠的构建方法的应用，其特征在于：包括人源HRAS mRNA表达验证：
4.如权利要求1-2中任一项所述的一种用于致癌性评价的HRAS人源化小鼠的构建方法的应用，其特征在于：包括人源HRAS蛋白表达验证：
5.如权利要求1-2中任一项所述的一种用于致癌性评价的HRAS人源化小鼠的构建方法的应用，其特征在于：包括小鼠自发成瘤验证。
6.如权利要求1-2中任一项所述的一种用于致癌性评价的HRAS人源化小鼠的构建方法的应用，其特征在于：包括致癌物MNU诱发小鼠致癌验证。
【技术特征摘要】
1.一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法，其特征在于：所述slic连接中鉴定成功的载体命名为tg-hras-donor。
3.如权利要求1-2中任一项所述的一种用于致癌性评价的hras人源化小鼠的构建方法的应用，其特征在于：包括人源hras mrna表达验证：
4....
【专利技术属性】
技术研发人员：琚存祥，曾文，杨笑柳，
申请(专利权)人：上海药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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