【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及致病菌检测，具体为一种致病菌多重分子的检测方法。
技术介绍
1、微生物质量是实验动物质量的核心指标，不仅会直接影响动物实验结果，同时也会对动物饲养人员及实验人员产生威胁，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌是实验小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔等实验动物常见的条件致病菌，也是人畜共患的致病微生物，国标gb14922-2022《实验动物微生物、寄生虫学等级及监测》明确要求肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌是无特定病原体级动物(spf动物)必须排除的病原微生物项目，金黄色葡萄球菌为必要时检测项目。
2、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌分布广泛，传播方式主要以接触传播及空气传播为主，感染实验动物后，主要以隐性感染为主，有潜伏期，在实验动物免疫功能低下、应激等情况下，会导致呼吸道和消化道等疾病，严重感染甚至造成动物死亡，目前我国实验动物微生物等级及监测国家标准gb/t14926.14-2001(金黄色葡萄球菌)，gb/t14926.13-2001(肺炎克雷伯杆菌),gb/t14926.17-2001(绿脓杆菌)中对三种病原体的检测方法有明确规定，推荐使用传统分离培养方法及生理生化方法检测，上述方法检测周期长，一般在3-7天，操作复杂，主要通过检测人员的经验进行主观判断，对于实验室环境及人员要求较高，同时普通的pcr/qpcr方法单次只能检测一种病原微生物，不符合简单、快速的临床检测需求，因此，临床检测上需要一种简单、快速、准确、客观的检测方法。
技术实现思路
1、(一
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种致病菌多重分子的检测方法，解决了目前无法为建立实验动物病原微生物快速、灵敏、标准化的检测方法提供实验依据的问题。
3、(二)技术方案
4、1.为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种致病菌多重分子的检测方法，包括以下步骤，
5、s1、实验试剂与材料准备：(1)菌株和样品，金黄色葡萄球菌atcc6538、肺炎克雷伯杆菌cmcc46117、绿脓杆菌atcc27853、肺炎链球菌atcc49619、鼠伤寒氏沙门菌atcc14028、假结核耶尔森菌cmcc53504、小肠结肠炎耶尔森菌cmcc52204、嗜肺巴斯德菌atcc35149、鼠棒状杆菌atcc15677、支气管鲍特杆菌atcc19395，(2)实验试剂，nac培养基、亚硒酸盐培养基、胆硫乳琼脂培养基、营养肉汤培养基，细菌基因组dna提取试剂盒；universaltaqmanmultiplexqpcrmastermix、粪便，基因组dna提取试剂盒，(3)实验仪器，生物安全柜，恒温培养箱，pcr扩增仪，rochelightcycler96qpcr仪，quawellq5000超微量紫外分光光度计，微量高速离心机，2compact及ensichek电子比浊仪；
6、s2、引物剂探针设计，根据genebank上公布的金黄色葡萄球菌nuc基因(ap017922.1)、肺炎克雷伯杆菌phoe基因(fo834906.1)、绿脓杆菌gyrb基因(cp007224.1),使用beacondesigner7.9软件设计引物和探针，使用ncbi-primerblast工具分析引物及探针的特异性；
7、s3、细菌dna提取，(1)过夜增菌：将金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌标准菌株接种至营养肉汤液体培养基中，37℃、120rpm/min，增菌24h；(2)使用细菌基因组dna提取试剂盒提取菌液中细菌基因组dna，具体实验操作可参考试剂盒说明书，(3)浓度测定：使用超微量分光光度计测定上述提取核酸的浓度，并记录，(4)梯度稀释：将已知浓度的核酸样品定容至10ng/ul，按1：10的比例进行梯度稀释，稀释后浓度分别为10ng/ul，1ng/ul，100pg/ul，10pg/ul，1pg/ul，100fg/ul,10fg/ul,1fg/ul；
8、s4、反应体系及程序，(1)反应体系，mn-qpcr反应体系为25ul，包括:universaltaqmanmultiplexqpcrmastermix12.5ul，引物0.9ul(sa-f/r0.15ul；kp-f/r0.15ul；pa-f/r0.15ul)，探针0.225ul(sa-p0.075ul，kp-p0.075ul；pa-p0.075ul)，dna3ul，加水补至25ul；(2)反应程序，mn-qpcr反应程序为37℃3min，95℃30s，95℃10s，60℃35s，2-4步40个循环，荧光通道选择fam、texasred、cy5；
9、s5、mn-qpcr方法对不同样品的扩增情况，将金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆和绿脓杆菌标准菌株的dna(10ng/ul)等比例混合制成“sa+pa”“sa+kp”“kp+pa”“sa+kp+pa”混合样品，以3种细菌dna及混合样品作为模板，无菌去离子水作为阴性对照，参照步骤4中的反应体系及程序，测试mn-qpcr方法的扩增情况；
10、s6、特异性检测，以肺炎链球菌、鼠伤寒氏沙门菌、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜肺巴斯德菌、鼠棒状杆菌、支气管鲍特杆菌等小鼠常检病原微生物阳性核酸作为阴性对照，“sa+kp+pa”3种细菌dna混合样品作为阳性对照，参照步骤4中的反应体系及程序，测试mn-qpcr方法的特异性；
11、s7、灵敏度检测，以梯度稀释浓度为10ng/ul～1fg/ulsa、kp、pa的dna作为样品，无菌无菌去离子水作为阴性对照，参照步骤4的反应体系及程序，测试mn-qpcr方法的检测灵敏度；
12、s8、标准曲线，以梯度稀释浓度为10ng/ul～10pg/ul的sa、kp、pa的dna作为样品扩增检测，检测结果利用rochelightcycler96qpcr仪专用分析软件绘制标准曲线；
13、s9、重复性试验，选取浓度为10ng/ul，1ng/ul，100pg/ul，10pg/ul的sa、kp、pa的dna作为样品，每个稀释梯度的样品分别进行三次批内和批间重复检测，无菌去离子水作为阴性对照，参照2.3的反应体系及程序，测试mn-qpcr方法的稳定性；
14、s10、临床样品检测，(1)过夜增菌：将sa、kp、pa的标准菌株接种至营养肉汤培养基中，37℃、120rpm/min，增菌24h；(2)菌液稀释：使用灭菌的营养肉汤培养基将金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌菌液成稀释麦氏比浊度mcf＝1的菌液；(3)阳性参考品：将1颗正常大小，检测合格的无菌小鼠粪便分别与浓度mcf＝1，体积1ml的sa、kp、pa的菌液混合，得到阳性参考品，(sa、kp、pa的阳性参考品各2份)；(4)样品收集：收集spf小鼠临床粪便样品30份。(5)核酸提取：使用粪便基因组提取试剂盒提取上述临床粪便样品中病原微生物核酸，具体操作参考试剂盒说明书；(6)样品检测：利用建立的mn-qpcr方法检测方法和培本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种致病菌多重分子的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
【技术特征摘要】
1.一种致病菌多重分子的检测方...
【专利技术属性】
技术研发人员：琚存祥，蔡利东，田苗苗，李乃馨，王馨宇，杨慧欣，
申请(专利权)人：上海药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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